尤佳，張寧，文義凱，吳家和，司懷軍*，王蒂

(1.甘肅省干旱生境作物學(xué)省部共建國家重點實驗室培育基地 甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.中國科學(xué)院微生物研究所植物基因組學(xué)國家重點實驗室，北京 100101)

馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsadecemlineata)屬鞘翅目葉甲科，又稱馬鈴薯葉甲或科羅拉多馬鈴薯甲蟲(Colorado potato beetle, CPB)，是國際公認(rèn)的毀滅性檢疫害蟲，也是我國重要外來入侵物種之一。因其具有高繁殖率、滯育和遷飛等習(xí)性，生態(tài)可塑性強，且世代重疊，防治難度大，其主要以成蟲和幼蟲取食葉片，通常將植株葉片吃光，僅剩莖稈，其危害造成馬鈴薯產(chǎn)量一般損失為30%～50%，嚴(yán)重者可達(dá)90%以上，甚至絕產(chǎn)。而且還可傳播病害，如褐斑病、環(huán)腐病等[1-2]。近年來我國檢疫部門通過口岸檢疫截獲馬鈴薯甲蟲的頻率在逐步增加[3]。由此可見，我國馬鈴薯甲蟲的防控形勢十分嚴(yán)峻。利用植物基因工程的方法選育優(yōu)良的抗蟲植物品種已被證實為一種控制蟲害的有效途徑[4]。目前全世界總共已獲得了50多種轉(zhuǎn)Bt基因植物[5]，在已獲得的轉(zhuǎn)Bt基因植物中，絕大多數(shù)植物對靶標(biāo)昆蟲產(chǎn)生了強烈的毒殺作用，有效地減輕了由害蟲所造成損失。盡管轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲植物在生產(chǎn)上已經(jīng)展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景，但依舊存在一些問題需要妥善地加以解決，否則就有可能影響其持續(xù)利用，甚至產(chǎn)生一些不良后果，其中昆蟲對轉(zhuǎn)Bt殺蟲晶體蛋白產(chǎn)生抗性的問題尤為嚴(yán)峻[6]。Bt-CryⅢA基因是一種能抗鞘翅目(Coleoptera)昆蟲的基因，Sutton等[7]對特異毒殺鞘翅目昆蟲的CryⅢA基因進行了重新合成。試驗顯示，表達(dá)該基因的煙草(Nicotianatabacum)蛋白質(zhì)提取物對CPB有明顯的抑制作用，表明改造后的CryⅢA基因在抗甲蟲轉(zhuǎn)基因植物研究上具有應(yīng)用價值，對抑制檢疫性害蟲CPB具有一定作用。Perlak等[8]用合成的CryⅢA基因，也獲得了可有效抵抗CPB的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯(Solanumtuberosum)植株。1995年，孟山都公司轉(zhuǎn)CryⅢA基因的抗甲蟲馬鈴薯新品種(Newleaf)獲準(zhǔn)商業(yè)化生產(chǎn)。

本研究選用的CryⅢA基因內(nèi)部含有植物表達(dá)載體pBI121的酶切位點，選用傳統(tǒng)的酶切連接方法需要采用平端連接的方法，為此首先需要Klenow酶將酶切后突出的5′末端填平，再用T4 DNA聚合酶將突出的3′末端刪去。為了減少載體的自身環(huán)化，還經(jīng)常采用牛小腸堿性磷酸酶將載體5′末端的磷酸基團去除[9]。但平端連接的效率非常低，而且較難確定插入片段的正反方向。為了實現(xiàn)定向克隆，人們常采用TA克隆載體進行重組，但要將目的基因插入片段克隆到所需要的載體上尚需一輪亞克隆，因此操作比較繁瑣，實驗難度大，工作周期長[10]。

In-Fusion克隆技術(shù)是新興發(fā)展起來的克隆技術(shù)，該技術(shù)的原理是目的基因的PCR引物的5′端加上與線性化載體同源的堿基序列，以使PCR的擴增產(chǎn)物兩端分別帶上15個和線性化載體兩端同源的堿基序列。In-Fusion酶可以識別PCR產(chǎn)物和線性化載體兩端的同源序列，將PCR產(chǎn)物置換到目標(biāo)載體上從而發(fā)生同源重組，這種技術(shù)不受載體和酶切位點限制，不附加冗余序列，適用于各種載體模型構(gòu)建，也可以完成多片段連接實驗和定點突變實驗，是一種快捷高效的克隆技術(shù)。本研究采用In-Fusion克隆技術(shù)成功構(gòu)建了組成型啟動子CaMV 35S和馬鈴薯莖葉特異表達(dá)啟動子ST-LS1驅(qū)動的CryⅢA基因植物表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化馬鈴薯獲得了轉(zhuǎn)基因植株，對CryⅢA基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)特性進行了分析，為選育抗甲蟲轉(zhuǎn)基因馬鈴薯新品系奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株和載體 大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404及植物表達(dá)載體pBI121由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室提供。含合成的蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白CryⅢA基因的質(zhì)粒pBin438-CryⅢA[11]，由中國科學(xué)院微生物研究所吳家和副研究員提供。將pBI121中的組成型啟動子CaMV 35S置換為馬鈴薯莖葉特異表達(dá)啟動子ST-LS1的質(zhì)粒的pBI121-ST-LS1由本實驗室構(gòu)建并保存。

1.1.2酶及生化試劑 LATaqDNA 聚合酶，限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ、BamHⅠ、SacⅠ，PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser，SYBR?Premix Ex TaqTMGC購自TaKaRa公司；In-Fusion?HD Cloning Kit購自Clontech公司；DNA膠回收試劑盒購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。常用的化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。溶液配方及常用抗生素與激素的配置詳見文獻[12]。

1.1.3引物設(shè)計 根據(jù)已知的CryⅢAcDNA的序列設(shè)計合成擴增引物，為了使擴增的目的片段與經(jīng)BamHⅠ和SacⅠ酶切后的線性化pBI121載體發(fā)生同源重組反應(yīng)，在擴增目的片段的上、下游引物的5′端分別加入與載體線性化位點兩側(cè)序列同源的15～20 bp。下劃線處為鑒定酶切位點，虛線為根據(jù)CryⅢA的CDS區(qū)序列設(shè)計的引物。正向引物infusion-F1: 5′-GGACTCTAGAGGATCCATGACTGCTGATAACAACACG-3′(下劃線為BamHⅠ位點)和反向引物infusion-R1:5′-GATCGGGGAAATTCGAGCTCTTAATTCACTGGAATGAA CTC-3′(下劃線為SacⅠ位點)。同理，準(zhǔn)確找出莖葉特異表達(dá)啟動子ST-LS1啟動GUS的表達(dá)載體pBI121-ST-LS1被限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、SacⅠ酶切成為線性載體后兩端15～20 bp的準(zhǔn)確序列，與根據(jù)CryⅢA的CDS區(qū)序列設(shè)計的引物按照要連接的方向拼成完整的定制引物。正向引物infusion-F2：5′-GTGAGAGCAAGGATCCATGACTGCTGATAACAACACG-3′(下劃線為BamHⅠ位點)和反向引物infusion-R2: 5′-GATCGGGGAAATTCGAGCTCTTAATTCACTGGAATGAACTC-3′(下劃線為SacⅠ位點)。另外在CryⅢA的CDS區(qū)序列中間設(shè)計一對普通引物作為檢測引物，序列為JCP-F：5′-CAGAAGATTGCCGATTACG-3′和JCP-R：5′-GAGTCGTTACCGTAGTATCCTG-3′，擴增片段大小為709 bp。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，用無菌去離子水溶解至終濃度為10 μmol/L，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

1.2.1目的片段的PCR 提取pBin438-CryⅢA的質(zhì)粒為模板，分別用正向引物infushion-F1、反向引物infusion-R1和正向引物infusion-F2、反向引物infusion-R2進行PCR擴增，反應(yīng)程序：94℃ 4 min， 94℃ 1 min，55℃ 1 min 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)，72℃ 10 min，4℃保存。用1.5%瓊脂糖進行PCR產(chǎn)物凝膠電泳，用DNA快速純化回收試劑盒回收目的片段，具體操作按產(chǎn)品說明書進行。

1.2.2植物表達(dá)載體pBI121線性化處理BamHⅠ和SacⅠ限制性酶雙酶切植物表達(dá)載體pBI121和pBI121-ST-LS1。酶切反應(yīng)體系為：質(zhì)粒DNA 8 μL+ddH2O 8 μL+10×K Buffer 2 μL+BamHⅠ1 μL+SacⅠ1 μL，反應(yīng)體系共20 μL。37℃恒溫酶切16 h，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，從膠上切下目的條帶，用DNA快速純化回收試劑盒回收目的片段，具體操作按產(chǎn)品說明書進行。

1.2.3建立In-Fusion連接體系 回收后的線性化載體和目的基因用Implen超微量分光光度計測濃度，根據(jù)目的基因與載體摩爾比10∶1來計算出各所需的體積，連接體系如下：5× In-Fusion HD Enzyme Premix 2 μL+Linearized Vector 6 μL+Purified PCR Fragment 2 μL，反應(yīng)體系共10 μL。50℃水浴反應(yīng)15 min，-20℃貯存。組成型啟動子CaMV 35S和馬鈴薯莖葉特異表達(dá)啟動子ST-LS1驅(qū)動的CryⅢA基因植物表達(dá)載體pBI121-CaMV35S-CryIIIA和pBI121-ST-LS1-CryIIIA構(gòu)建示意圖分別見圖1和圖2。

圖1 植物表達(dá)載體pBI121-CaMV35S-CryIIIA構(gòu)建示意圖

圖2 植物表達(dá)載體pBI121-ST-LS1-CryIIIA構(gòu)建示意圖

將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用質(zhì)粒PCR和酶切鑒定的方法證明構(gòu)建是否成功。CaMV 35S驅(qū)動的CryⅢA基因重組載體質(zhì)粒用BamHⅠ和SacⅠ進行雙酶切鑒定；ST-LS1驅(qū)動CryⅢA基因重組載體除了用BamHⅠ和SacⅠ進行雙酶切鑒定外，用BamHⅠ和HindⅢ也進行一次雙酶切。雙酶切反應(yīng)體系：質(zhì)粒DNA 8 μL+ddH2O 8 μL+10×K Buffer 2 μL+BamHⅠ1 μL+SacⅠ(HindⅢ)1 μL，37℃，6 h。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。目的基因序列的測定由上海生工有限公司完成。正確后即可用于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化方法見文獻[13]，轉(zhuǎn)化及鑒定方法參照文獻[14-17]。

1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯試管薯遺傳轉(zhuǎn)化與植株再生

1.3.1馬鈴薯試管薯的誘導(dǎo) 以馬鈴薯栽培品種隴薯3號和甘農(nóng)薯2號為實驗材料。試管苗在無菌條件下剪成帶有2個腋芽的莖段，轉(zhuǎn)接到MS+3%蔗糖+0.45%瓊脂的固體培養(yǎng)基上。用150 mL三角瓶培養(yǎng)，每瓶裝50 mL固體培養(yǎng)基，接種5個莖段，2000 lx光照下培養(yǎng)3 周，形成壯苗。將試管苗在MS+3%蔗糖的液體培養(yǎng)基上生長3 周后，倒出三角瓶中的液體培養(yǎng)基，加入50 mL的誘導(dǎo)培養(yǎng)基[MS+5 mg/L 6-BA(6-芐氨基嘌呤，6-benzylaminopurine)+8%蔗糖]，置于暗處條件下誘導(dǎo)結(jié)薯。

1.3.2誘導(dǎo)芽與生根選擇壓的確定 將直徑為5 mm左右的馬鈴薯試管薯從三角瓶里取出后切成厚度為1 mm左右的薄片，分別接種于附加 0，25，50，75 mg/L Kan(卡那霉素，kanamycin)的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基為 MS+1 mg/L IAA(吲哚-3-乙酸，indole-3-acetic acid)+0.2 mg/L GA3(赤霉素，gibberellic acid)+0.5 mg/L 6-BA+2 mg/L ZT(玉米素核苷，zeatin riboside)。培養(yǎng)4 周后，確定抑制芽分化的最低 Kan濃度。將無菌試管苗剪成帶有2個腋芽的莖段接種于分別附加 50，75，100 mg/L Kan的MS培養(yǎng)基上，3 周后觀察無菌苗的生根狀況，并確定抑制生根的最低Kan濃度。

1.3.3農(nóng)桿菌工程菌液的制備 吸取1 mL含目的基因的農(nóng)桿菌菌液接種于50 mL含Kan(50 mg/L)和Rif(利福平，rifampicin，50 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，于28℃、260 r/min避光振蕩培養(yǎng)過夜。吸取1 mL接種于50 mL含 Kan(50 mg/L)和Rif(50 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中28℃、260 r/min避光振蕩培養(yǎng)3～4 h至對數(shù)生長期，然后轉(zhuǎn)入無菌離心管中，于5000 r/min離心6 min，收集菌體用等量液體MS培養(yǎng)基重新懸浮后用于轉(zhuǎn)化，其處理所用菌液濃度OD600為0.5。

1.3.4外植體侵染與植株再生 將直徑為0.5 cm左右的試管薯切成2 mm的薄片，置于農(nóng)桿菌工程菌液中浸泡7 min，期間不斷搖動，使菌液與薯片充分接觸。然后用無菌濾紙吸去多余菌液，轉(zhuǎn)入固體MS培養(yǎng)基于28℃、黑暗條件下共培養(yǎng)2 d，然后轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基[MS+1 mg/L IAA+0.2 mg/L GA3+0.5 mg/L 6-BA+2 mg/L ZT+50 mg/L Kan+200 mg/L Carb(羧芐青霉素，carbenicillin)]，置于光照度2000 lx，光周期16 h/d，溫度24℃的條件下，10 d換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)3～4 周即可分化出芽。待芽長0.5～1.0 cm時切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(MS+100 mg/L Kan+200 mg/L Carb)，進行生根篩選和擴繁。

1.4 轉(zhuǎn)基因植株鑒定

1.4.1轉(zhuǎn)化再生植株的 PCR檢測 將待檢測植株和對照植株的葉片用 CTAB(十六烷基三甲基溴化胺，cetyltrimethyl ammonium bromide)法提取總DNA。參照 Sambrook等[14]的方法對抗性植株進行 PCR 檢測。以檢測引物JCP-F和JCP-R進行 PCR 擴增，預(yù)期片段大小為709 bp。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 結(jié)果。

1.4.2轉(zhuǎn)基因植株的實時熒光定量(qRT-PCR)檢測與分析 分別提取DNA檢測呈陽性植株的莖、葉和根總RNA，用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑進行反轉(zhuǎn)錄，具體操作按產(chǎn)品說明書進行。以馬鈴薯ef1a基因為內(nèi)參(擴增引物為ef1a-F：5′-CAAGGATGACCCAGCCAAG-3′和ef1a-R：5′-TTCCTTACCTGAACGCCTGT-3′)，以CryⅢA基因序列設(shè)計一對特異性較高的引物Bt-F：5′-TCTACAGAGCCGTGGCAAAC-3′和Bt-R：5′-CTGGGATGGTTC CTCTGCTAC-3′。利用SYBR熒光染料法進行轉(zhuǎn)基因植株實時熒光定量(qRT-PCR)檢測與分析[14]，根據(jù)公式2-△△Ct計算出CryⅢA基因在根、莖、葉中的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物表達(dá)載體構(gòu)建

2.1.1組成型表達(dá)啟動子CaMV 35S驅(qū)動的CryⅢA基因表達(dá)載體構(gòu)建 對重組載體進行質(zhì)粒PCR鑒定，檢測引物JCP-F和JCP-R擴出約700 bp大小的條帶(圖3泳道1)，引物infusion-F1和infusion-R1擴出約1800 bp大小的條帶(CryⅢA基因大小為1794 bp，引物還含有線性化載體兩端共36 bp大小的堿基)，擴增得到的目的片段與預(yù)期大小一致(圖3泳道2)。用BamHⅠ和SacⅠ進行重組質(zhì)粒雙酶切鑒定，獲得大小約13000,1500,300 bp三條帶(CryⅢA基因第328個堿基位置含有SacⅠ的酶切位點，用SacⅠ進行酶切不僅可以將其從重組載體上切下，而且會從中間切斷，基因整體大小為1794 bp，酶切后會成為1466和328 bp兩個片段)，得到目的片段大小均與預(yù)期大小一致(圖4)。 重組質(zhì)粒經(jīng)上海生工有限公司測序表明得到的序列正確。

2.1.2馬鈴薯莖葉特異表達(dá)啟動子ST-LS1驅(qū)動的CryⅢA基因表達(dá)載體構(gòu)建 對重組載體進行質(zhì)粒PCR鑒定，檢測引物JCP-F和JCP-R擴出約700 bp大小的條帶(圖5泳道2)，引物infusion-F2和infusion-R2擴出約1800 bp大小的條帶，與預(yù)期大小一致(圖5泳道1)。分別用BamHⅠ和SacⅠ、BamHⅠ和HindⅢ進行重組質(zhì)粒雙酶切鑒定，BamHⅠ和SacⅠ切出大小應(yīng)為13000,1500和300 bp三條帶(CryⅢA基因第328個堿基位置含有SacⅠ的酶切位點，用SacⅠ進行酶切后會成為1466和328 bp兩個片段)。BamHⅠ和HindⅢ雙酶切得到大小約14000和1600 bp兩條帶(莖葉特異啟動子ST-LS1啟動GUS的表達(dá)載體pBI121大小為15459 bp，切掉GUS連上CryⅢA基因大小為15359 bp，啟動子大小為1572 bp)，得到目的片段大小均與預(yù)期大小一致(圖6)。重組質(zhì)粒經(jīng)上海生工有限公司測序表明得到的序列正確。

圖3 重組質(zhì)粒pBI121-CaMV35S-CryIIIA的PCR擴增鑒定

圖4 重組質(zhì)粒pBI121-CaMV35S-CryIIIA的酶切鑒定

圖5 重組質(zhì)粒pBI121-ST-LS1-CryIIIA的PCR擴增鑒定

利用凍融法將2個重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，挑取單克隆的轉(zhuǎn)化菌接種培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA進行PCR鑒定，能特異地擴增出大小約1800 bp(引物infusion-F2和infusion-R2)和700 bp(引物JCP-F和JCP-R)左右的片段，表明2個重組質(zhì)粒均成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。

2.2 馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化與生根選擇壓的確定

馬鈴薯試管薯薄片在芽分化培養(yǎng)基上經(jīng)過2～3 周的培養(yǎng)，未轉(zhuǎn)化對照組的外植體能直接分化長出綠色健壯小芽；在25 mg/L Kan選擇濃度下，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化外植體分化芽的情況與對照無明顯差異；在50 mg/L Kan選擇濃度下，對照組外植體已經(jīng)基本不能分化出芽。因而確定芽誘導(dǎo)時Kan的選擇壓為50 mg/L。4 周后，轉(zhuǎn)化試管薯薄片分化出綠色小芽(圖7)。馬鈴薯植株經(jīng)過3 周的生根選擇培養(yǎng)，未轉(zhuǎn)化對照組的植株未能生根(圖8)，而轉(zhuǎn)化植株能夠正常生根(圖8，9)。

圖7 試管薯薄片在含有卡那霉素的分化培養(yǎng)基上再生出綠色小芽

圖8 轉(zhuǎn)化植株在附加100 mg/L Kan培養(yǎng)基上進行生根選擇

圖9 轉(zhuǎn)化植株在附加100 mg/L Kan培養(yǎng)基上生根

2.3 轉(zhuǎn)基因植株檢測與分析

PCR擴增產(chǎn)物的電泳分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化植株可擴增到709 bp的特異性條帶，而未轉(zhuǎn)化的植株中無該片段的產(chǎn)生(圖10)，從而初步證明再生植株為轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)Kan抗性生根篩選和PCR擴增鑒定共獲得10株抗性植株，對其進行qRT-PCR檢測，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株有典型的熒光擴增曲線；且其Ct值都小于40，而非轉(zhuǎn)基因植株和空白對照其熒光擴增曲線都呈現(xiàn)平直，且都位于閾值線之下。CaMV 35S為組成型強啟動子，其驅(qū)動的CryⅢA轉(zhuǎn)基因馬鈴薯在不同組織中基因均有表達(dá)，從相對表達(dá)量來看，CryⅢA基因在馬鈴薯根、莖、葉中的表達(dá)有顯著差異，其中葉的平均表達(dá)量是莖和根的4～5倍(圖11)；莖葉特異表達(dá)啟動子ST-LS1驅(qū)動的CryⅢA轉(zhuǎn)基因馬鈴薯莖、葉中有表達(dá)，根的熒光擴增曲線呈現(xiàn)平直，未見表達(dá)，從相對表達(dá)量來看，葉的表達(dá)量也高出莖4倍左右(圖12)。

圖10 部分轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測

圖11 pBI121-CaMV35S-CryIIIA轉(zhuǎn)基因植株的qRT-PCR組織特異性表達(dá)檢測

圖12 pBI121-ST-LS1-CryIIIA轉(zhuǎn)基因植株的qRT-PCR組織特異性表達(dá)檢測

3 討論

基因重組技術(shù)是分子生物學(xué)中常用的方法，是研究基因功能的基本手段。但在基因重組中經(jīng)常會出現(xiàn)插入的目的基因片段與載體的酶切位點不匹配，致使基因重組出現(xiàn)困難。為解決酶切位點不匹配的情況，人們常采用平端連接，但是平端連接的操作步驟多，連接效率極低以及需要鑒定正反向插入等缺點。為克服上述困難，本實驗采用In-Fusion技術(shù)成功構(gòu)建了組成型啟動子CaMV 35S和馬鈴薯莖葉特異表達(dá)啟動子ST-LS1驅(qū)動的CryⅢA基因植物表達(dá)載體。In-Fusion技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒具有以下優(yōu)點：適用范圍極廣，平、粘末端連接都適用，只要線性化載體就行；不用連接酶、不用載體的去磷酸化、反應(yīng)混合物50℃水浴15 min即可，節(jié)省了時間；可以實現(xiàn)靶向克隆，避免了鑒定正反向插入的麻煩；插入的目的基因從起始密碼子序列開始，沒有兩端多余的序列，不影響后續(xù)基因的表達(dá)；重組效率高；無需末端抹平。該方法避免了傳統(tǒng)克隆方法難以克服的困難，是一種簡便高效、省時省力的基因克隆手段。實驗?zāi)芊癯晒Φ年P(guān)鍵在于引物的設(shè)計。這種方法引物設(shè)計的原則是引物的5′末端必須包含與載體末端相同的15個堿基序列，引物的3′末端必須包含與目的基因片段相互補的特異堿基序列，補齊酶切位點缺失堿基。該實驗采用的infusion酶，可以識別PCR產(chǎn)物和線性化載體的兩端同源序列，并將PCR產(chǎn)物置換到目標(biāo)載體上從而發(fā)生同源重組。在這一過程中，為了提高同源重組率，目的基因片段和目標(biāo)載體的比例要合適，二者的摩爾數(shù)之比一般(8～10)∶1較好。PCR產(chǎn)物濃度會比酶切回收的載體濃度高很多，所以合理控制二者比例才能有效連接。

CryⅢA基因編碼的Bt毒素蛋白具有對人、畜及害蟲天敵極少或完全沒有毒害作用的特點，已成為目前世界上應(yīng)用最廣泛地微生物殺蟲劑。自從 1987 年比利時的Vaeck等[18]報道了首例轉(zhuǎn)Bt基因煙草的研究結(jié)果以來，Bt毒素蛋白基因已在煙草、棉花(Gossypiumspp.)、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、番茄(Solanumlycopersicum)、甘藍(lán)(Brassicaoleracea)等50余種植物上獲得成功[19-20]。Cooper等[21]已經(jīng)成功獲得抗馬鈴薯甲蟲的轉(zhuǎn)Bt基因馬鈴薯，國內(nèi)也有少數(shù)相關(guān)的研究報道[22]。盡管運用現(xiàn)代基因工程技術(shù)得到了大量的轉(zhuǎn)Bt基因植物，然而隨著轉(zhuǎn)Bt毒蛋白基因植物的大面積種植，給昆蟲造成很高的選擇壓力，可能會使昆蟲對此毒蛋白產(chǎn)生抗性，這些不容忽視的問題限制了這些轉(zhuǎn)基因植物向商品化、實用化方向發(fā)展。為此，本研究運用CaMV 35S強組成型啟動子驅(qū)動CryⅢA基因來提高Bt毒蛋白基因的表達(dá)量來提高轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲性；同時，本研究充分考慮到基因表達(dá)的時空特異性，選用馬鈴薯莖葉特異表達(dá)啟動子ST-LS1，使目的基因CryⅢA基因只限定在容易被馬鈴薯甲蟲危害的葉片和莖稈中特異表達(dá)，從而實現(xiàn)對目的基因的表達(dá)調(diào)控，而目的基因在塊莖中不表達(dá)，從而使人們食用轉(zhuǎn)基因馬鈴薯更加安全。本研究通過qRT-PCR檢測分析表明在CaMV 35S和ST-LS1啟動子驅(qū)動的CryⅢA轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株中，CryⅢA基因在葉中的表達(dá)量最高，且在ST-LS1啟動子驅(qū)動的CryⅢA轉(zhuǎn)基因植株的根中未見表達(dá)。對于轉(zhuǎn)基因植株抗蟲效果的鑒定正在進行中。

4 結(jié)論

采用In-Fusion技術(shù)成功構(gòu)建了組成型啟動子CaMV 35S和馬鈴薯莖葉特異表達(dá)啟動子ST-LS1驅(qū)動的CryⅢA基因植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化馬鈴薯栽培品種獲得了轉(zhuǎn)基因植株，應(yīng)用組織特異性表達(dá)啟動子ST-LS1實現(xiàn)了目的基因的定向表達(dá)，為豐富轉(zhuǎn)基因理論和培育抗甲蟲轉(zhuǎn)基因馬鈴薯新品系奠定了基礎(chǔ)。