柳學(xué)周，史 寶，王珊珊，徐永江，李曉曉

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島市海水魚類種子工程與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266071）

1 前言

脊椎動(dòng)物生殖活動(dòng)主要受下丘腦—腦垂體—性腺軸（HPG）3個(gè)不同層次的內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)控。促性腺激素（GTH）是由垂體合成和分泌的一類糖蛋白激素，在魚類的性腺發(fā)育、性類固醇及多肽類激素調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。腦垂體GTH包括促濾泡激素（FSH）和促黃體激素（LH），它們是異源二聚體，都是由α和β亞基以非共價(jià)鍵相連組成的二聚體結(jié)構(gòu)，其中α亞基氨基酸組成相同，而β亞基明顯不同，具有特異的生物學(xué)作用。

通過對(duì)大馬哈魚（Oncorhynchusketa）GTH生物學(xué)功能的研究，發(fā)現(xiàn)兩種GTH在表達(dá)模式及生殖周期不同發(fā)育階段的水平有所不同[1]。生理學(xué)研究表明，LH主要調(diào)控性腺成熟及排精/排卵[2～4]。LH由腦垂體前葉細(xì)胞分泌，通過血液循環(huán)到達(dá)性腺及其他組織，魚類LH相應(yīng)生物學(xué)功能及水平的變化規(guī)律已有報(bào)道。用放射免疫法測(cè)定虹鱒魚（Oncorhynchus mykiss）[5]的GTH，發(fā)現(xiàn)LH在排精及卵母細(xì)胞最終成熟和排卵時(shí)大量分泌并達(dá)到最高峰，促使卵母細(xì)胞和精子最終成熟并刺激排卵排精。

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis Günther）是重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類，屬秋季產(chǎn)卵型魚類[6]，自然繁殖季節(jié)為9—10月份，卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞發(fā)育不同步，是分批成熟多次產(chǎn)卵類型魚類[7]。近年來，半滑舌鰨生殖調(diào)控及規(guī)?；斯し庇夹g(shù)的研究獲得重大突破[8]。目前，國(guó)內(nèi)外多種硬骨魚類的LH cDNA序列已成功克隆，包括鯉形目[9]、鱸形目[10]、鰻鱺目[11]和鮭形目[12]等，但關(guān)于半滑舌鰨LH的研究尚未見報(bào)道。本文應(yīng)用分子生物學(xué)和碘（125I）放射免疫分析法（RIA），克隆得到半滑舌鰨LH的全長(zhǎng)cDNA序列，對(duì)其mRNA組織表達(dá)及繁殖周期表達(dá)特征進(jìn)行分析，并檢測(cè)血漿LH在雌性半滑舌鰨繁殖周期的變化規(guī)律，揭示其可能的生理功能，以期為魚類促性腺激素及生殖內(nèi)分泌調(diào)控的研究提供科學(xué)依據(jù)，為提高半滑舌鰨全人工育苗和轉(zhuǎn)季節(jié)育苗的生殖調(diào)控效率提供理論參考。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用半滑舌鰨于2011年6月—2012年1月采自青島忠海水產(chǎn)有限公司。實(shí)驗(yàn)魚為野生親魚自然產(chǎn)卵后，人工育苗得到的健康苗種，經(jīng)室內(nèi)人工養(yǎng)成達(dá)到性成熟年齡的F1代親魚。研究用15尾雌性親魚全長(zhǎng)53～66 cm，體重1 266.3～2 271.0 g。親魚培育條件：全年開放流水培育，人工調(diào)控親魚發(fā)育及產(chǎn)卵過程，產(chǎn)卵前2個(gè)月左右進(jìn)行親魚強(qiáng)化培育。水溫由20℃逐漸提高到25℃，并使用遮光幕和白熾燈進(jìn)行光照強(qiáng)度和光照節(jié)律的調(diào)節(jié)，控制光強(qiáng)200～300 lx，光照時(shí)間由8 h/d逐漸增加到12 h/d[13]。將半滑舌鰨各組織樣品取出，迅速于液氮中凍存，并轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫硬僮饕苊飧鳂悠烽g的交叉污染。Davidedsons液固定卵巢組織用于組織學(xué)觀察。

2.2 藥品和試劑

RNA提取試劑RNAiso Plus、Taq酶、DNaseⅠ（RNasefree）、RNasin、SYBR Prem ix Ex TaqTMⅡ試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，SMARTTMRACE cDNA擴(kuò)增試劑盒、Advantage 2 PCR試劑盒購(gòu)自Clontech公司，E.Z.N.AGelExtraction Kit普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司，pEASY-T1載體、Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自全式金公司，其余均為國(guó)產(chǎn)分析純。所有PCR引物由TaKa-Ra公司合成，序列由北京華大基因公司測(cè)定。血漿中LH含量的測(cè)定，試劑盒Iodine[125I]-LH RIA Kit購(gòu)自天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司。

2.3 卵巢組織學(xué)分析

卵巢組織經(jīng)常規(guī)梯度乙醇脫水后，二甲苯透明，石蠟包埋。LEICA RM 2235型切片機(jī)（德國(guó)）切片，厚度為5～7μm，H.E染色，中性樹膠封片，LEICA DW 4000B型顯微鏡（德國(guó)）下觀察及顯微攝影。參考半滑舌鰨卵巢發(fā)育組織學(xué)研究中的分類標(biāo)準(zhǔn)[14]，確定卵巢發(fā)育情況。

2.4 總RNA的提取和cDNA的合成

取-80℃保存的半滑舌鰨各組織：腦、垂體、鰓、心、頭腎、腎、肝、脾、胃、腸、卵巢、肌肉各50～100 mg，用RNAiso Plus抽提總RNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，采用Nanodrop2000（美國(guó)Thermo公司）測(cè)定總RNA濃度。各組織RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 半滑舌鰨LH基因克隆

-20℃保存的cDNA作為PCR模板，通過RTPCR反應(yīng)獲得半滑舌鰨LH基因的保守片段，所用引物為L(zhǎng)HF和LHR。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，切下目的條帶，使用E.Z.N.A Gel Extraction Kit回收純化PCR產(chǎn)物（操作步驟嚴(yán)格按照OMEGA公司膠回收試劑盒說明書）?；厥债a(chǎn)物與pEASY-T1克隆載體連接，重組子轉(zhuǎn)化至Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細(xì)胞，在含氨芐青霉素的LB平板上37℃培養(yǎng)過夜，挑取陽(yáng)性克隆送至北京華大公司測(cè)序。

根據(jù)擴(kuò)增得到的序列設(shè)計(jì)特異性引物L(fēng)HGSP1、LHNGSP1（5’RACE）和 LHGSP2（3’RACE），應(yīng)用SMARTTMRACE cDNA擴(kuò)增試劑盒克隆半滑舌鰨LH cDNA全長(zhǎng)。提取新鮮垂體組織總RNA，用于5’-RACE及3’-RACE cDNA第一鏈合成，合成的cDNA第一鏈分別用Advantage 2 PCR試劑盒（Clontech公司）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25μL，反應(yīng)條件為94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃2 m in，共25個(gè)循環(huán)。取5μL產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，再次對(duì)目的條帶進(jìn)行回收、與載體連接、轉(zhuǎn)化、篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序。實(shí)驗(yàn)中所用的引物見表1。

2.6 序列分析

Dnastar軟件分析蛋白分子量和等電點(diǎn)；所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，分析半滑舌鰨LH與其他物種的LH同源性高低；從GenBank中選擇脊椎動(dòng)物哺乳綱和魚綱的物種的LH序列，魚綱分類到目，具體見表2。這些序列用于同源性比較及進(jìn)化樹構(gòu)建。運(yùn)用Clustal X2進(jìn)行多重序列比對(duì)；系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建使用MEGA4.0軟件中Neighbor-joining法（自展值為1 000）。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物及其序列Table 1 Sequencesof the primersused for the PCR analysis

2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)m RNA組織及周期表達(dá)差異

根據(jù)克隆得到的半滑舌鰨LH cDNA的序列，設(shè)計(jì)并合成引物L(fēng)HF1和LHR1，同時(shí)合成18S F和18SR作為內(nèi)參引物。對(duì)繁殖周期半滑舌鰨表達(dá)分析，每個(gè)發(fā)育階段分別取3條半滑舌鰨，并且每個(gè)實(shí)驗(yàn)魚設(shè)定3個(gè)平行。取半滑舌鰨組織，合成cDNA第一鏈，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）方法檢測(cè)LHmRNA在不同組織及繁殖周期的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)體系參考SYBR Prem ix Ex TaqTMⅡ（寶生物工程（大連）有限公司）試劑盒說明書，使用2-Step法，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃預(yù)變性5 s，60℃預(yù)變性22 s，共40個(gè)循環(huán)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)在Eppendorf公司的Mastercycler eprealplex上進(jìn)行，并收集反應(yīng)信息。程序運(yùn)行完成后進(jìn)行熔解曲線分析以確定引物及反應(yīng)是否正常。為保證結(jié)果的可靠性，進(jìn)行三次平行試驗(yàn)。所得數(shù)據(jù)采用SPSS（13.0）統(tǒng)計(jì)進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan’s多重比較分析，P＜0.05表示差異顯著。最后依據(jù)2-△△Ct方法[15]，制作出mRNA相對(duì)表達(dá)量的關(guān)系圖表。

表2 同源性比較及進(jìn)化樹中引用的基因序列號(hào)Table2 Genbank accession number of genesused for homologue and phylogenesis analysis

2.8 血漿LH繁殖周期濃度測(cè)定

實(shí)驗(yàn)用魚同2.1節(jié)實(shí)驗(yàn)材料。即在每次取樣時(shí)都對(duì)半滑舌鰨進(jìn)行抽血，12 000 r/m in、4℃離心10 min，吸取上清液。血清于-20℃保存?zhèn)溆?。采用碘?25I）RIA法測(cè)定血漿中LH含量，先制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，當(dāng)相關(guān)系數(shù)R接近于1時(shí)，曲線理想，如圖1所示。然后，每個(gè)樣品雙管平行上樣于FJ-2008PSγ放射免疫計(jì)數(shù)器進(jìn)行檢測(cè)，樣品間再設(shè)兩個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD），使用SPSS16.0軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)分析。

圖1 血漿LH測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線（R=0.999 7）Fig.1 The determination stand and curve of plasma LH（R=0.999 7）

3 結(jié)果

3.1 LH序列分析

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，使用引物L(fēng)HF和LHR獲得長(zhǎng)度為197 bp的保守片段。經(jīng)RACE反應(yīng)后克隆測(cè)序，將5’-RACE和3’-RACE所得片段與所獲得保守序列拼接得到LH基因cDNA全長(zhǎng)，其長(zhǎng)度為670 bp，開放閱讀框?yàn)?77 bp，編碼158個(gè)氨基酸，其分子量為18 kD，等電點(diǎn)為5.9；第1到第25個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，成熟肽序列包含12個(gè)保守的半胱氨酸殘基（Cys）。且此序列3’端非編碼區(qū)含有一個(gè)加尾信號(hào)AATAAA（見圖2），該序列已提交至GenBank（序列號(hào)JQ277934）。圖3為半滑舌鰨LH氨基酸與其他物種的比較。

3.2 LH氨基酸序列比對(duì)及同源性分析

圖2 半滑舌鰨LH全長(zhǎng)以及推斷的氨基酸序列分析Fig.2 cDNA sequence and putative amino acid sequence of the LH of C.semilaevis

圖3 半滑舌鰨LH氨基酸與其他物種LH氨基酸序列的比較Fig.3 Alignment amino acid of C.semilaevis LH with other species

半滑舌鰨LH成熟肽與鰈形目魚類LH成熟肽的相似性分別為塞內(nèi)加爾鰨（Solea senegalensis）66%、庸鰈（Hippoglossus hippoglossus）69%和牙鲆（Paralichthys olivaceus）67%。半滑舌鰨LH成熟肽與鱸形目魚類LH成熟肽的相似性分別為斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）74%、真鯛（Pagrusmajor）74%和尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）73%。半滑舌鰨LH成熟肽與鯉形目魚類LH成熟肽的相似性分別為金魚（Carassius auratus）58%和斑馬魚（Danio rerio）54%。

半滑舌鰨的LH成熟肽與其他硬骨魚類和人類的LH進(jìn)行多序列比對(duì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，半滑舌鰨LH氨基酸具有糖蛋白激素保守的12個(gè)半胱氨酸殘基。在半滑舌鰨的LH成熟肽的氨基酸序列中，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)：19～21 NQT；該糖基化位點(diǎn)在大多數(shù)硬骨魚類是保守的。在半滑舌鰨成熟肽序列中存在與其他動(dòng)物高度保守的特征基序如LH的第4個(gè)半胱氨酸殘基位點(diǎn)和第5個(gè)半胱氨酸殘基位點(diǎn)之間存在著硬骨魚類特異性的Cys-Ser-Gly-His（CSGH）區(qū)域。

3.3 LH系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過MEGA4.0軟件Neighbor-Joining法構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹（見圖4），置信度檢驗(yàn)1 000次，獲得的進(jìn)化樹表明硬骨魚類LH聚類，親緣關(guān)系較近；而與哺乳類和鳥類等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。不同物種LH氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)：半滑舌鰨LH與鰈形目和鱸形目的LH相似性（58%～68%）比鮭形目（48%～50%）、鯉形目（47%～51%）、鰻鱺目（47%）、鲇形目（48%）和高等脊椎動(dòng)物人類（34%）LH同源性高。但是半滑舌鰨LH與鰈形目中的其他魚類LH同源性相對(duì)低（58%～64%），與鱸形目LH同源性較接近（64%～68%）；這可能是導(dǎo)致鰈形目LH不能聚為一簇的原因。

3.4 LHm RNA在不同組織的表達(dá)分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，檢測(cè)LH在半滑舌鰨的腦、垂體、鰓、心、頭腎、腎、肝臟、脾臟、胃、腸、卵巢、肌肉12種組織中的表達(dá)。結(jié)果如圖5所示，LH在所有組織中都有表達(dá)，在垂體相對(duì)表達(dá)量最高，在腦和卵巢中表達(dá)量相對(duì)較豐富，分別比垂體低約78 740倍和5 180倍。另外，在鰓、心、頭腎、腎、肝臟、脾臟、胃、腸、肌肉這9個(gè)組織中，LH mRNA雖然表達(dá)量非常小，但仍可檢測(cè)到表達(dá)。單因素方差分析結(jié)果顯示，LHmRNA在垂體的表達(dá)與其他組織中的表達(dá)量差異顯著（P＜0.05）。

圖4 基于MEGA4.0中的NJ方法的半滑舌鰨LH與其他物種分子進(jìn)化樹聚類分析Fig.4 Phylogenetic tree of the LH from C.semilaevis and other vertebrates in M EGA4.0

3.5 半滑舌鰨組織學(xué)

對(duì)實(shí)驗(yàn)用魚的卵巢進(jìn)行組織切片和H-E染色，并進(jìn)行半滑舌鰨卵巢發(fā)育分期（見圖6）。Ⅱ期卵巢：幾乎全為Ⅱ時(shí)相卵母細(xì)胞；胞質(zhì)嗜堿性，可見數(shù)個(gè)核仁（見圖6a）。Ⅲ期卵巢：排列緊密，以Ⅲ時(shí)相卵母細(xì)胞為主，也有Ⅱ時(shí)相卵母細(xì)胞存在。細(xì)胞體積增大，呈規(guī)則的橢圓形。胞質(zhì)嗜堿性，胞核內(nèi)可見大量核仁（見圖6b）。Ⅳ期卵巢：以Ⅳ時(shí)相卵母細(xì)胞為主，可見少量Ⅱ時(shí)相和Ⅲ時(shí)相卵母細(xì)胞。體積顯著增加，輻射帶增厚，胞質(zhì)內(nèi)卵黃顆粒充滿，偏嗜酸性（見圖6c）。Ⅴ期卵巢：以Ⅴ時(shí)相卵母細(xì)胞為主，體積繼續(xù)增大，胞質(zhì)中充滿粗大的卵黃顆粒，并逐漸融合成塊狀；細(xì)胞核偏位，核膜逐漸模糊（見圖6d）。Ⅵ期卵巢：可見正在退化的卵母細(xì)胞，有少數(shù)Ⅱ和Ⅲ時(shí)相的卵母細(xì)胞，放射膜厚，卵黃顆粒、胞核模糊消失，可見閉鎖空泡（見圖6e）。

圖5 半滑舌鰨LHmRNA在不同組織中的表達(dá)水平Fig.5 Expression level of LH m RNA in different tissues of C.semilaevis tissues

3.6 LH m RNA在雌性半滑舌鰨繁殖周期的表達(dá)模式

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)雌性半滑舌鰨LHmRNA在繁殖周期Ⅱ～Ⅵ期的腦、垂體、卵巢3個(gè)組織中的表達(dá)水平，表明LHmRNA在Ⅱ～Ⅵ各繁殖周期的腦、垂體、卵巢3個(gè)組織都有表達(dá)，但表達(dá)水平有差異，具體結(jié)果見圖7。

圖6 半滑舌鰨卵巢不同發(fā)育時(shí)期的組織切片F(xiàn)ig.6 The stained sections for each of ovarian development stageof C.semilaevis Günther

圖7 LH m RNA在雌性半滑舌鰨繁殖周期的表達(dá)水平Fig.7 Expression level of LHm RNA in reproductive cycles of female C.semilaevis

腦組織中，LH mRNA在Ⅱ～Ⅴ期表達(dá)水平下降，Ⅳ期急劇下降，到Ⅴ期時(shí)達(dá)最低水平，并明顯低于其他發(fā)育期水平，Ⅵ期時(shí)又有所回升。由SPSS16.0軟件顯著性檢驗(yàn)分析得出，LH mRNA在各繁殖周期腦組織的表達(dá)水平差異顯著（P＜0.05）。垂體組織中，LHmRNA的表達(dá)水平在Ⅱ～Ⅴ期穩(wěn)步上升，Ⅴ期達(dá)最高水平，Ⅵ期下降基本與Ⅱ期表達(dá)水平相同。顯著性檢驗(yàn)分析表明，垂體LH mRNA在Ⅱ、Ⅵ發(fā)育期的表達(dá)處于同一低水平，差異不顯著（P＞0.05），并與Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ發(fā)育期的高表達(dá)水平差異顯著（P＜0.05）。說明垂體組織的LH在性腺成熟及排卵時(shí)期（尤其Ⅴ期）水平高，而卵巢發(fā)育前期和排卵后水平較低。卵巢組織中，LHmRNA的表達(dá)水平在Ⅱ～Ⅴ期逐漸上升，到Ⅴ期時(shí)達(dá)最高水平，Ⅵ期急劇下降，達(dá)最低值。顯著性檢驗(yàn)分析表明，卵巢LHmRNA各發(fā)育期的表達(dá)水平差異顯著（P＜0.05）。推測(cè)卵巢LH主要對(duì)卵母細(xì)胞最終成熟及卵子排出的卵巢起作用，Ⅴ期卵巢已完全成熟；Ⅵ期卵巢退化，此時(shí)卵巢除含有很多退化的卵母細(xì)胞外，一部分卵母細(xì)胞退化至Ⅱ、Ⅳ時(shí)相，此時(shí)卵巢LH發(fā)揮相對(duì)較弱的生理作用。

3.7 血清LH在雌性半滑舌鰨繁殖周期的變化規(guī)律

雌性半滑舌鰨繁殖周期血清LH濃度變化呈現(xiàn)明顯的周期性變化規(guī)律，即呈先上升后下降的趨勢(shì)。Ⅱ期時(shí)濃度最低，均值為3.24m IU/m L；之后上升，Ⅴ期時(shí)達(dá)到最大濃度，均值為4.80m IU/m L，說明LH在卵巢發(fā)育至Ⅴ期（即卵母細(xì)胞成熟及排卵）時(shí)發(fā)揮最大作用，LH主要參與卵子的成熟及排放過程；Ⅵ期濃度明顯下降（P＜0.05），均值只有3.55 m IU/m L，說明卵母細(xì)胞退化時(shí)LH作用有所減弱；但濃度高于Ⅱ期，此時(shí)卵巢內(nèi)存在退化的Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ時(shí)相卵母細(xì)胞（見圖8）。

圖8 雌性半滑舌鰨繁殖周期血漿LH的濃度Fig.8 Concentration of plasma LH in reproductive cycles of female C.semilaevis

雌性半滑舌鰨繁殖周期，采用碘（125I）RIA法測(cè)定血漿LH變化規(guī)律與實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)到的LHmRNA水平在垂體及卵巢組織的變化規(guī)律基本一致。

4 討論

4.1 半滑舌鰨LH基因克隆及序列分析

本實(shí)驗(yàn)克隆了半滑舌鰨LH cDNA的全長(zhǎng)序列，并對(duì)半滑舌鰨的LH與其他脊椎動(dòng)物氨基酸序列的同源性進(jìn)行比較，結(jié)果顯示半滑舌鰨LH同鰈形目、鱸形目的LH相似性較高，而同哺乳動(dòng)物L(fēng)H的相似性相對(duì)低。半滑舌鰨LH成熟肽序列包含12個(gè)半胱氨酸殘基Cys，與所比對(duì)的各物種中完全保守（見圖4），并與GTHα亞基交聯(lián)形成二硫鍵，參與蛋白折疊及配體受體相互作用[16]，因此，硬骨魚類LH結(jié)構(gòu)的變化會(huì)影響到與受體結(jié)合能力及異源二聚體的穩(wěn)定性。四足類及硬骨魚類的LHβ存在與GTHα結(jié)合相關(guān)的某些重要的氨基酸殘基，比如一些硬骨魚類第4個(gè)和第5個(gè)Cys位點(diǎn)之間就存在著特異性的Cys-Ser-Gly-His（CSGH）區(qū)域[17]，半滑舌鰨的這一結(jié)構(gòu)（見圖4）也能反映LH在進(jìn)化中高度的保守性。另有研究發(fā)現(xiàn)，鰨目魚LH多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)有一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，與其他硬骨魚類和高等脊椎動(dòng)物保持高度保守性，這一結(jié)構(gòu)可能與有機(jī)體的生物合成及激素調(diào)控有關(guān)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨LH也有1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)Asn（19～21 NQT）（見圖4），具體生理機(jī)能有待進(jìn)一步探究。依據(jù)Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨LH與鰈形目中的其他魚類LH同源性（58%～64%）比鱸形目（64%～68%）相對(duì)較低，這可能是導(dǎo)致鰈形目LH不能聚為一簇的原因。

4.2 LH基因在繁殖季節(jié)半滑舌鰨的組織表達(dá)

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)LH基因在半滑舌鰨各組織的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：所有組織中均有表達(dá)，垂體表達(dá)量最豐富，其他組織表達(dá)量都很小，腦和性腺相對(duì)表達(dá)量較高。在尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）、紅大馬哈魚（Oncorhynchus nerka）[19]、金頭鯛（Sparusaurata）[20]和斑馬魚（Danio rerio）[21]的研究中，利用半定量實(shí)時(shí)PCR方法和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)方法，檢測(cè)到LHmRNA在非垂體組織中亦有表達(dá)，與本研究結(jié)果相似。但有關(guān)LH mRNA在非垂體組織中廣泛表達(dá)的生理機(jī)制尚未明確，推測(cè)半滑舌鰨LH可能具有更加廣泛的垂體外的生理功能，對(duì)此進(jìn)行深入研究具有重要意義。

4.3 雌性半滑舌鰨LHmRNA周期表達(dá)模式分析

本研究表明半滑舌鰨卵巢發(fā)育至Ⅱ期，LH mRNA表達(dá)量相對(duì)低，之后mRNA水平逐漸穩(wěn)步上升；直到Ⅳ～Ⅴ期mRNA表達(dá)量急劇增大。說明LH主要促進(jìn)卵母細(xì)胞最終成熟及排卵。有研究利用原位雜交、放射免疫、Northern blot、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法，檢測(cè)虹鱒魚[22～24]、許氏平鲉（Sebastes schlegeli）[25]、斑點(diǎn)叉尾鮰[26]的LH，發(fā)現(xiàn)卵巢最終成熟及排卵時(shí)LHmRNA水平急劇上升，并起主導(dǎo)作用。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

各時(shí)期LH不同的表達(dá)水平可能與其受體時(shí)空表達(dá)的差異性相關(guān)。斑點(diǎn)叉尾鮰的研究表明，垂體LH水平同卵巢LHR水平的變化規(guī)律基本一致，推測(cè)LH與其受體結(jié)合具有高度的特異性。但陳曉燕[27]對(duì)半滑舌鰨LHRmRNA進(jìn)行相關(guān)研究，顯示LHR在Ⅲ期卵巢和腦中表達(dá)量最豐富，與本研究結(jié)果有所不同。因此，半滑舌鰨LH與其受體結(jié)合的高度特異性有待進(jìn)一步研究。

4.4 雌性半滑舌鰨血清LH周期變化及其與LH基因表達(dá)關(guān)系

實(shí)驗(yàn)采用RIA方法，檢測(cè)半滑舌鰨血清LH在卵母細(xì)胞生長(zhǎng)、卵黃生成、卵子成熟及排卵等各時(shí)期的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：性腺發(fā)育早期（即卵黃生成作用），血清LH濃度逐漸穩(wěn)步上升，直到排卵時(shí)（Ⅴ期卵巢）濃度最大。揭示卵黃生成階段垂體內(nèi)LH大量合成并積累，從而排卵時(shí)血清LH濃度達(dá)到最高。由此可見，半滑舌鰨血清LH激素分泌的變化規(guī)律與卵巢發(fā)育、卵母細(xì)胞生長(zhǎng)、成熟及退化基本一致，在卵子成熟及排卵時(shí)期起主導(dǎo)作用。這與早期虹鱒的研究結(jié)果相一致。虹鱒LH垂體合成及其血清濃度不同步，LHmRNA先在垂體合成，之后LH激素進(jìn)入血液循環(huán)[28]，發(fā)揮相應(yīng)生理學(xué)作用。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，雌性半滑舌鰨繁殖周期，血漿LH濃度的變化規(guī)律同LHmRNA水平在垂體及卵巢組織的變化規(guī)律基本一致。但對(duì)于半滑舌鰨LH垂體合成及血漿濃度是否同步，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。

GtH的合成及釋放受各種因素制約，其中性類固醇激素作用最大。許多研究表明，虹鱒[29]、歐洲鰻鱺[30]及銀大馬哈魚[31]血清LH的含量及mRNA水平與性類固醇激素有關(guān)。在血清FSH及E2[32]水平已達(dá)最高值的卵黃生成后期，LH濃度才急劇上升，說明雌激素能刺激LH垂體內(nèi)合成，從而血漿LH濃度增大。半滑舌鰨GtH的合成釋放與性類固醇激素的相互作用關(guān)系有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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