王蔚芳，李青梅，柴書軍，甘玲玲，洪 磊，郭軍慶，雷霽霖

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島市海水魚類種子工程與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266071；

2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州450002；3.四川省富順縣水產(chǎn)漁政局，四川富順643200）

1 前言

大菱鲆（Scophthalmus maximus）是20世紀(jì)90年代由歐洲引進(jìn)我國(guó)的名貴魚種，在突破繁育、創(chuàng)建“溫室大棚+深井海水”養(yǎng)殖模式的基礎(chǔ)上，如今歷經(jīng)20年風(fēng)雨的大菱鲆養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)已經(jīng)展現(xiàn)出強(qiáng)大的生命力和發(fā)展?jié)摿?，并成為我?guó)工廠化養(yǎng)殖的樣板工程，帶動(dòng)了沿海其他養(yǎng)殖魚類產(chǎn)業(yè)的提升與轉(zhuǎn)型。然而在其工業(yè)化發(fā)展進(jìn)程中，循環(huán)水、高密度的養(yǎng)殖模式對(duì)疾病防控技術(shù)的要求亟待提升。在當(dāng)前日益增長(zhǎng)的環(huán)保理念和食品安全意識(shí)的要求下，以疫苗等為主要代表的免疫病害防控技術(shù)受到重視，通過(guò)免疫防控途徑能有效增強(qiáng)魚體主動(dòng)防御能力，減少疾病的發(fā)生概率[1]。然而對(duì)大菱鲆免疫學(xué)的研究報(bào)道有限，Kofod等[2]分離純化了大菱鲆免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM），Estévez等[3]制備了大菱鲆免疫球蛋白單克隆抗體，王賢麗等[4]從大菱鲆脾臟cDNA文庫(kù)中篩選得到了免疫球蛋白L輕鏈的全長(zhǎng)cDNA片段，馮守明等[5]對(duì)大菱鲆免疫相關(guān)組織中免疫球蛋白陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)，丁冰潔等[6]首次得到了大菱鲆多聚免疫球蛋白受體完整的cDNA序列。未見大菱鲆IgM單克隆抗體相關(guān)研制和應(yīng)用的報(bào)道。

單克隆抗體具有均一性、高效性、特異性、生物活性單一性及可無(wú)限供應(yīng)等特點(diǎn)，將單克隆抗體技術(shù)應(yīng)用于大菱鲆免疫球蛋白結(jié)構(gòu)和功能分析、病原和抗體檢測(cè)、疫苗研制及免疫應(yīng)答規(guī)律研究等方面具有科學(xué)理論意義和生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。因此，本研究將純化的大菱鲆IgM免疫BALB/C小鼠，利用細(xì)胞工程技術(shù)生產(chǎn)融合的雜交瘤細(xì)胞，篩選分泌大菱鲆IgM的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，制備并生產(chǎn)大菱鲆IgM單克隆抗體。

2 材料與方法

2.1 免疫原制備

純化的大菱鲆血清IgM由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存[7]。將純化的大菱鲆IgM分別與等體積的弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑（Pierce，USA）混勻乳化后免疫小鼠。

2.2 免疫動(dòng)物

選用6周齡BALB/C雌性小鼠進(jìn)行免疫，免疫程序見表1。

表1 免疫程序Table 1 The immunization schedule

2.3 飼養(yǎng)細(xì)胞制備

脫頸椎處死正常BALB/C小鼠，無(wú)菌條件下剪開腹部皮毛，用注射器吸取5m LRPM I-1640培養(yǎng)基（含10%新生牛血清和1%次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷溶液）后注射到小鼠腹膜內(nèi)，同時(shí)輕壓小鼠腹腔，然后將培養(yǎng)基吸入注射器內(nèi)并移出；將吸出的腹腔液轉(zhuǎn)移到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待用。

2.4 細(xì)胞融合

1）脫頸椎處死免疫小鼠，無(wú)菌取出脾臟，過(guò)100目篩網(wǎng)后用GNK（葡萄糖、NaCl、KCl、酚紅及磷酸鹽）溶液洗滌2次，然后溶于10m LGNK溶液，吹打形成單細(xì)胞懸液。

2）取105個(gè)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NS0骨髓瘤細(xì)胞（由英國(guó)國(guó)家動(dòng)物健康研究院惠贈(zèng)），1 000 r/m in，離心10 min，棄上清液，用40m L GNK溶液重懸沉淀物。

3）將脾細(xì)胞懸液和骨髓瘤細(xì)胞懸液混合均勻后，1 000 r/m in，離心10m in，完全吸除上清液，輕彈離心管底，打散細(xì)胞，放入37℃水浴中；加入37℃預(yù)熱好的聚乙二醇溶液1m L，在1m in內(nèi)滴加完，然后在37℃水浴中緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)90 s。

4）加入已經(jīng)預(yù)熱到37℃的GNK溶液15m L（開始緩慢滴加，后來(lái)逐漸加快速度），然后繼續(xù)緩慢滴加GNK溶液至40m L，并在37℃水浴中靜置5m in。

5）1 000 r/m in，離心10m in，用預(yù)熱好的RPM I-1640培養(yǎng)基（含10%新生牛血清和1%次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶核苷溶液）稀釋沉淀的細(xì)胞，然后加到96孔含飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板中。

6）將培養(yǎng)板放入二氧化碳培養(yǎng)箱（二氧化碳5%，37℃）中培養(yǎng)，并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，大概5～7天后進(jìn)行換液，吸出100μL培養(yǎng)液，更換等量含次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶核苷溶液的培養(yǎng)液。

2.5 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的篩選

細(xì)胞融合后10天左右，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好并開始檢測(cè)篩選，將篩選的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)篩選步驟如下：以0.05mol/L（pH=9.6）碳酸鹽溶液稀釋大菱鲆免疫球蛋白至2μg/m L，取50μL稀釋液加入酶標(biāo)板孔中，置于4℃冰箱中過(guò)夜包被，次日以0.01mol/L（pH=7.4）磷酸鹽-吐溫溶液（PBST，0.05%Tween-20）洗滌3次，每次3m in；用5%豬血清于37℃封閉1 h，封閉結(jié)束后以PBST同法洗滌；加入雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，每孔加入50μL，陰性對(duì)照為細(xì)胞培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照為免疫小鼠血清，于37℃反應(yīng)15min后以PBST同法洗滌；然后每孔加入50μL羊抗鼠IgGHRP（1∶1 000稀釋），于37℃ 反應(yīng)30m in后洗滌；每孔加入新配制的50μL顯色液TMB（四甲基聯(lián)苯胺）顯色5m in后，加入2mol/L硫酸溶液50μL終止反應(yīng)；結(jié)果判定用自動(dòng)酶標(biāo)儀讀取OD450值（P/N≥2.1時(shí)判定為陽(yáng)性）。

2.6 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞系的建立與克隆

采用有限稀釋法對(duì)篩選出的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克?。涸?6孔細(xì)胞培養(yǎng)板各孔中加入100μL的飼養(yǎng)細(xì)胞；然后把要克隆的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞孔中的細(xì)胞用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)液以10倍梯度進(jìn)行稀釋，取出100個(gè)雜交瘤細(xì)胞；將取出的雜交瘤細(xì)胞混勻后，滴加到鋪滿飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中，每孔加入100μL，平均每孔含有一個(gè)雜交瘤細(xì)胞；然后放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。期間，定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況并記錄，并通過(guò)上述ELISA法檢測(cè)各培養(yǎng)孔的上清液（確保陽(yáng)性率100%），把所得陽(yáng)性克隆孔的雜交瘤細(xì)胞按上述方法再克隆一次，以保證形成單克隆。

2.7 腹水制備（單抗大量生產(chǎn)）

1）小鼠預(yù)處理：在接種雜交瘤細(xì)胞前1周，用0.5m L液體石蠟腹腔注射正常BALB/C小鼠。

2）接種雜交瘤細(xì)胞：將培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞離心，棄去上清，雜交瘤細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)液懸浮，并將細(xì)胞數(shù)調(diào)至106/m L，每只小鼠腹腔注射0.5m L。

3）采集腹水：接種雜交瘤細(xì)胞后約7～12天，小鼠腹部可見明顯膨大。用75%酒精棉球消毒腹部皮膚后，用注射器抽取腹水。每只小鼠抽取腹水2m L，間隔5天后，待腹水再生積聚后，同法抽取。

4）腹水處理：收集的腹水3 000 r/m in離心20min，收集上清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.8 單抗特性鑒定

2.8.1 ELISA法測(cè)定單抗效價(jià)

以2μg/m L純化大菱鲆免疫球蛋白包被酶標(biāo)板，每孔50μL，4℃過(guò)夜，封閉后加細(xì)胞上清液和腹水抗體，細(xì)胞上清液從1∶100倍比稀釋到1∶12 800，腹水從 1∶1 000倍比稀釋到 1∶2 048 000，每孔50μL，其余步驟同2.5節(jié)。

2.8.2 單抗靈敏度的測(cè)定

純化的大菱鲆IgM起始濃度為2μg/m L，倍比稀釋至2 ng/m L，每孔50μL，4℃過(guò)夜包被，封閉洗滌后滴加單抗（1∶25 000），每孔50μL，其余步驟同2.5節(jié)。

2.8.3 單抗Western blot分析

SDS-PAGE分離純化的大菱鲆免疫球蛋白（凝膠由10%分離膠和3%濃縮膠組成），將電泳凝膠轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜（孔徑0.22μm）上，轉(zhuǎn)印完畢將硝酸纖維素膜用脫脂奶粉封閉1 h，PBST洗滌后將硝酸纖維素膜置于腹水稀釋液中（1∶250 000）緩慢搖動(dòng)1 h，同法洗滌后，將硝酸纖維素膜置于羊抗鼠IgG-HRP（1∶500稀釋）緩慢搖動(dòng)1 h，同法洗滌后，將硝酸纖維素膜放入HRP-DAB底物顯色液中，至顏色清晰為止，然后將硝酸纖維素膜用去離子水沖洗干凈后，置于濾紙間干燥，拍照記錄后暗處保存。

2.8.4 單抗特異性的測(cè)定

收集大菱鲆、褐牙鲆、半滑舌鰨、紅鰭東方鲀、鯉魚、鯽魚、草魚、鳙魚、許氏平鲉、六線魚、鱸魚血清，待檢魚血清用包被液以1：100倍稀釋后包被于酶標(biāo)板，每孔50μL，4℃過(guò)夜，封閉洗滌后加單抗（1∶25 000），每孔50μL，其余步驟同2.5節(jié)。

3 結(jié)果

3.1 單抗的篩選

采用上述免疫和細(xì)胞融合方法，用直接ELISA法對(duì)培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，獲得4株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，編號(hào)分別為B1D1、D5C2、E1B2、F4A1。雜交瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)3次亞克隆篩選，保證100%的陽(yáng)性率，經(jīng)連續(xù)傳代培養(yǎng)后依然能夠穩(wěn)定分泌抗體。

3.2 單抗特性鑒定

經(jīng)直接ELISA法檢測(cè)，4株單抗的細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)為1∶1 280～1∶2 560，其中E1B2的細(xì)胞上清及腹水效價(jià)分別為1∶2 560和1∶1.024×106。

用不同濃度的大菱鲆IgM包被96孔板，ELISA法測(cè)定單抗E1B2的敏感性，結(jié)果表明E1B2腹水對(duì)大菱鲆IgM的檢測(cè)靈敏度為32 ng/m L。

應(yīng)用SDS-PAGE技術(shù)，對(duì)獲得單抗進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果表明單抗能與大菱鲆IgM發(fā)生特異性結(jié)合，特異識(shí)別IgM重鏈區(qū)（見圖1）。

圖1 單抗的Western blot圖譜Fig.1 Western blot analysis of monoclonal antibody against IgM of turbot

3.3 單抗特異性測(cè)定

將單抗與不同種類的魚血清進(jìn)行ELISA反應(yīng)，結(jié)果表明單抗與大菱鲆血清呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，與褐牙鲆、紅鰭東方鲀、許氏平鲆、六線魚、鱸魚均呈微弱陽(yáng)性反應(yīng)，而與半滑舌鰨、鯉魚、鯽魚、草魚、鳙魚的血清無(wú)交叉反應(yīng)（見圖2）。

圖2 ELISA法檢測(cè)單抗與各種魚血清的交叉反應(yīng)Fig.2 The reaction of monoclonal antibody again stserum from eleven species of fish by ELISA

4 討論

單克隆抗體能夠特異性識(shí)別單一抗原決定簇，且經(jīng)過(guò)多次克隆和篩選獲得，從而避免交叉反應(yīng)帶來(lái)的假陽(yáng)性，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到納克水平，是免疫學(xué)和血清學(xué)研究的重要工具。魚類是具有細(xì)胞免疫和體液免疫系統(tǒng)的最低等的脊椎動(dòng)物，已報(bào)道在魚類免疫系統(tǒng)中存在4種主要的免疫球蛋白（IgM、IgD、IgT和IgZ）[8]，其中IgM發(fā)現(xiàn)最早、研究最多。魚類免疫球蛋白的單抗不僅可以用于魚類免疫細(xì)胞的鑒定、發(fā)生和活性研究，也可用于監(jiān)測(cè)病原感染或疫苗接種過(guò)程中的免疫應(yīng)答反應(yīng)，是魚類免疫機(jī)理和魚病免疫防治研究的有力工具。

在大菱鲆IgM單抗制備過(guò)程中，免疫原IgM的提純是關(guān)鍵的一步。通常免疫原越純，單抗效果越佳。在本研究中，大菱鲆IgM的提取和純化是建立在實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)完成的相關(guān)工作基礎(chǔ)上進(jìn)行的，獲得的IgM純度高，經(jīng)SDS-PAGE檢驗(yàn)，大菱鲆血清IgM有兩條帶，分子質(zhì)量分別是76 kD和27 kD，代表免疫球蛋白的重鏈和輕鏈，條帶清晰，無(wú)雜帶[7]。在此基礎(chǔ)上，將其免疫小鼠，通過(guò)細(xì)胞融合及多次克隆和篩選，獲得了穩(wěn)定分泌大菱鲆IgM的雜交瘤細(xì)胞株。生產(chǎn)的單抗效價(jià)高（1∶1.024×106）、檢測(cè)靈敏度高（32 ng/m L），有效保證其在大菱鲆相關(guān)免疫學(xué)研究中的應(yīng)用。

本研究通過(guò)Western blot方法對(duì)制備單抗的特性鑒定分析表明，單抗能特異識(shí)別大菱鲆IgM的重鏈。在草魚、歐洲鰻、花鱸、南方鲇等魚血清IgM單抗研究中也發(fā)現(xiàn)，大部分單抗僅識(shí)別IgM重鏈[9～12]。這可能是由于IgM分子重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可提供多個(gè)抗原表位；而輕鏈相對(duì)簡(jiǎn)單，其上免疫表位少，所以篩選到的強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞株大部分是抗重鏈的，而在篩選過(guò)程中抗輕鏈的雜交瘤細(xì)胞很容易被放棄和丟失。

在交叉實(shí)驗(yàn)中，研制的單抗與半滑舌鰨及草魚、鯉魚、鳙魚、鯽魚4種淡水魚類的血清無(wú)交叉反應(yīng)，與鱸魚、六線魚、許氏平鲉、紅鰭東方鲀、牙鲆五種海水魚類血清有微弱的交叉反應(yīng)，而與大菱鲆的血清反應(yīng)是最強(qiáng)烈的，表明該單抗具有較好的特異性。同時(shí)，也可以看出，不同魚類的免疫球蛋白存在特異性抗原位點(diǎn)，但也存在相同的抗原決定簇，這種共同的抗原決定簇會(huì)存在于親緣關(guān)系較近的品種之間。

5 結(jié)語(yǔ)

單克隆抗體技術(shù)在人類及畜牧業(yè)的疾病控制與預(yù)防中發(fā)揮著重要作用，是疾病的檢測(cè)、預(yù)防和治療的有力武器。單克隆抗體能夠在實(shí)驗(yàn)室通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)而得到批量生產(chǎn)，在應(yīng)用上具有專一性強(qiáng)、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，有較高的科研應(yīng)用價(jià)值和生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用前景。本研究制備的大菱鲆IgM單克隆抗體效價(jià)高、靈敏度高、特異性強(qiáng)，適合用于大菱鲆免疫學(xué)相關(guān)研究和生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用。

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