江莉莎， 鄔亭亭， 劉 平， 郭述良△

1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，重慶 400016

2成都市第三人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，成都 610031

3重慶市長壽區(qū)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶 401220

多重耐藥結(jié)核分枝桿菌（MDR－TB）以及泛耐藥結(jié)核分枝桿菌（XDR－TB）的增多，使探索結(jié)核病治療的新方法變得尤為重要。早在二十世紀(jì)三十年代，噬菌體就開始應(yīng)用于細(xì)菌感染的治療，后因抗生素的使用而被逐步取代。噬菌體D29也已成功應(yīng)用于結(jié)核病的診斷和治療［1－2］。但是細(xì)菌對(duì)噬菌體快速耐藥變異，使噬菌體療法面臨巨大挑戰(zhàn)。單一噬菌體應(yīng)用易使細(xì)菌對(duì)噬菌體產(chǎn)生抗性，而篩選多種噬菌體組成“雞尾酒制劑”，能夠一定程度上減少耐藥變異的產(chǎn)生［3］。再者，由于抗生素與噬菌體的耐藥機(jī)制不同，如果將兩者同時(shí)應(yīng)用，也會(huì)大大減少耐藥突變株的產(chǎn)生［4］。因此，篩選能有效裂解結(jié)核分支桿菌的噬菌體，制成雞尾酒制劑，并與抗生素聯(lián)合應(yīng)用將成為結(jié)核病治療的新思路。本課題組對(duì)噬菌體Leo進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)它能裂解敏感和耐藥的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株，其噬菌斑透明清晰，呈裂解性噬菌體的特點(diǎn)。為進(jìn)一步了解噬菌體Leo的遺傳背景，明確其能否應(yīng)用于雞尾酒療法，遂對(duì)其進(jìn)行基因測序及生物信息學(xué)分析。

1 材料與方法

1．1 菌株和噬菌體

恥 垢 分 枝 桿 菌 （Mycobacterium smegmatis，MS）mc2155（CMCC 93202）由中國藥品生物制品檢定所王國治教授饋贈(zèng)。結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv（CMCC 93004）購自重慶市肺科醫(yī)院，結(jié)核分枝桿菌臨床分離株由本院結(jié)核患者痰中分離并保存，采用羅氏藥敏培養(yǎng)液（珠海貝索公司）進(jìn)行菌種和藥敏檢測，噬菌體Leo由加拿大拉瓦爾大學(xué) Félix d’Hérelle噬菌體中心提供。

1．2 噬菌體Leo制備

取10μL Leo噬菌體液與100μL恥垢分枝桿菌混合，靜置15min后加入3mL 7H9半固體培養(yǎng)基（BD，美國）混勻后傾倒于已制備的7H10固體培養(yǎng)基（BD，美國）平皿上，37℃倒置培養(yǎng)［5］。次日觀察噬菌斑形態(tài)及透明度。

1．3 電鏡觀察

取20μL噬菌體液滴于銅網(wǎng)上，待噬菌體自然沉降15min后，加入20μL 2%磷鎢酸于銅網(wǎng)上，染色10min，濾紙吸取多余染液，自然干燥后電鏡觀察噬菌體形態(tài)。

1．4 噬菌體Leo宿主譜

采用單斑法［6］測定噬菌體的宿主譜，宿主菌為分支桿菌臨床分離株32株、結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv，步驟如下。將稀釋的各宿主菌分別制成均勻的菌苔。將噬菌體樣液（滴度：1×109pfu／mL）10 μL滴加到菌苔上，待完全晾干后放入37℃孵箱培養(yǎng)，連續(xù)6周觀察結(jié)果。以恥垢分枝桿菌為陽性對(duì)照，出現(xiàn)噬菌斑者為陽性，6周以后還未出現(xiàn)噬菌斑者判為陰性。

1．5 噬菌體Leo全基因組序列測定

采用λ噬菌體提取試劑盒（北京艾比根公司）提取噬菌體Leo的DNA，參照說明書操作。噬菌體Leo測序按鳥槍法原理在北京六合華大基因科技股份有 限 公 司 完 成，DNA 序 列 用 Phred／PhraD／Consedh軟件包組裝，拼接重疊群，PCR擴(kuò)增連接重疊群缺口。GenBank登錄號(hào)KC787110。

1．6 噬菌體Leo基因組成分分析

采用DNAStar軟件包的EditSeq軟件分析基因組大小、GC含量，TRF軟件預(yù)測DNA序列中的串聯(lián)重復(fù)序列，運(yùn)用tRNAscan－SE軟件對(duì)噬菌體Leo基因組中tRNA基因進(jìn)行搜索。同時(shí)采用Promoter prediction／Prokaryotic程 序 （http：／／www．fruitfly．org／seq＿tools／promoter．html）預(yù)測啟動(dòng)子區(qū)。

1．7 噬菌體Leo基因功能預(yù)測分析

采用Glimmer3．0基因預(yù)測軟件對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行基因de novo 預(yù)測，使用 Blastall 2．2．21結(jié)合各個(gè)數(shù)據(jù)庫（nr，swissport，tremble，cog），對(duì)推定基因進(jìn)行同源比對(duì)，進(jìn)行功能注釋。

1．8 共線性分析

將噬菌體Leo基因與公共數(shù)據(jù)庫基因進(jìn)行blast m8比對(duì)，然后用perl語言，生成svg的共線性圖。

1．9 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

參照文獻(xiàn)［7］中的方法，運(yùn)用Blastn2．2．29＋，在核酸數(shù)據(jù)庫中檢索所有已知的與Leo基因組相似的噬菌體基因組，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2．1 噬菌體Leo噬菌斑形態(tài)及顆粒形態(tài)

噬菌體Leo噬菌斑圓形透明，邊緣清晰，呈裂解性噬菌體的特點(diǎn)。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，噬菌體Leo由頭部和尾部構(gòu)成，頭部為對(duì)稱的多面體結(jié)構(gòu)，直徑（70．0±3．0）nm，尾部可彎曲，長（211．0±31．7）nm（圖1）。

圖1 電鏡觀察噬菌體LeoFig．1 Electron micrograph of the phage Leo

2．2 噬菌體Leo宿主譜

噬菌體Leo宿主譜廣，能裂解全部的結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株及結(jié)核分枝桿菌臨床敏感菌株，并能裂解大部分的結(jié)核分枝桿菌臨床耐藥菌株。噬菌體Leo對(duì)耐藥牛結(jié)核分枝桿菌及非結(jié)核分枝桿菌也有一定的裂解作用，見表1。

表1 噬菌體Leo宿主譜Table 1 Host range of the phage Leo

2．3 基因組組成成分分析

噬菌體Leo基因組全長39 981bp，其中A占18．7%，C占33．5%，G占33．4%，T占14．4%，GC含量為66．86%。用tRNA scan－SE軟件未檢索到噬菌體Leo含tRNA區(qū)域，通過TRF軟件檢索噬菌體Leo串聯(lián)重復(fù)序列，未檢索到重復(fù)序列。

2．4 啟動(dòng)子預(yù)測分析

采用 Promoter prediction／Prokaryotic程序?qū)κ删wLeo的啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)4個(gè)區(qū)域具有與啟動(dòng)子序列結(jié)構(gòu)相似的特征，對(duì)比基因的位置以及啟動(dòng)子位于結(jié)構(gòu)基因的上游，推測Leo噬菌體基因組有3個(gè)可能的啟動(dòng)子區(qū)，見表2。

表2 噬菌體Leo可能的啟動(dòng)子區(qū)Table 2 Possible promoter sequence of the phage Leo

2．5 基因組功能預(yù)測分析

噬菌體Leo基因組經(jīng)glimmer 3．0基因預(yù)測，發(fā)現(xiàn)有59個(gè)推定基因，起始密碼子多使用ATG，少數(shù)為GTG。Leo基因組中前一基因的終止密碼子與后一基因的起始密碼子重疊現(xiàn)象較少見。大多數(shù)基因位于正鏈上，向右轉(zhuǎn)錄，最長基因?yàn)榛?6（1 337bp），最短為基因50（44bp），其中有20個(gè)基因有推測功能，見表3。Leo含9個(gè)結(jié)構(gòu)基因，基因32位于負(fù)鏈上，編碼整合酶，但基因組中未發(fā)現(xiàn)編碼阻遏蛋白的基因，因此噬菌體Leo為裂解性分枝桿菌噬菌體。同時(shí)對(duì)各個(gè)編碼基因進(jìn)行分析，未發(fā)現(xiàn)致病基因和毒力基因，符合安全性要求［8］。

表3 噬菌體Leo基因注釋Table 3 Gene annotation of the phage Leo

續(xù)表

2．6 共線性分析

噬菌體Leo 59個(gè)基因中有55個(gè)基因與BPs和Angel有高度的同源性（圖2），相似度為93．22%，共線性清晰，可歸為G簇分枝桿菌噬菌體。

2．7 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，噬菌體Leo與7株已完成測序的噬菌體親緣關(guān)系較近，分別是BO4，DNAⅢ，Liefie，BPs，Halo，Hope，Angel。其中關(guān)系最近的是BO4和DNAⅢ，這2株噬菌體均由本課題組完成測序，證實(shí)為G簇噬菌體［9－10］。且噬菌體BPs，Halo，Hope，Angel均為G簇噬菌體，表明噬菌體Leo為G簇噬菌體。

圖2 噬菌體Leo基因共線性分析Fig．2 Colinearity analysis of the genes of the phage Leo

圖3 噬菌體Leo系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig．3 Phylogenetic tree of the phage Leo

3 討論

Leo基因組全長39 981bp，是目前已知的最小的噬菌體基因組之一［11］。Leo基因組含相對(duì)長的左臂（gene1－31）和相對(duì)短的右臂（gene33－59）。Leo gene32與噬菌體Halo編碼整合酶的基因（gene32）相似度極高（95．96%），推定為編碼整合酶的基因。但Leo基因組中未找到編碼阻遏蛋白的基因。一般認(rèn)為溶源性噬菌體必須含有整合酶和有活性的阻遏蛋白，才能確保其溶源性［12］。因此Leo為裂解性噬菌體。

分析顯示，大部分結(jié)構(gòu)基因位于左臂上，與噬菌體Halo或BPs的結(jié)構(gòu)基因相似性極高。其中噬菌體Leo編碼次要微絲蛋白的基因（gene22）與BPs gene22和Halo gene22相似。有研究通過噬菌斑篩選，得到對(duì)結(jié)核分枝桿菌高效能感染的G簇噬菌體突變株。經(jīng)基因測序發(fā)現(xiàn)，在噬菌體Halo及BPs突變株中，編碼次要微絲蛋白的基因（gene22）在604位點(diǎn)（A604E）或306位點(diǎn)（A306V）及其附近發(fā)生氨基酸突變。同時(shí)，對(duì)噬菌體Halo gene22上述2位點(diǎn)附近進(jìn)行氨基酸突變后，得到了高效感染結(jié)核菌的噬菌體［13］。因此，推測若對(duì)噬菌體Leo gene22的604位點(diǎn)或306位點(diǎn)附近進(jìn)行相應(yīng)的氨基酸突變，能夠得到對(duì)結(jié)核分枝桿菌高感染效能的突變株，提高其對(duì)結(jié)核分枝桿菌的裂解能力。

分枝桿菌噬菌體在結(jié)核病的診斷和治療方面有一定的優(yōu)勢［14］。但是某些分枝桿菌噬菌體基因組中包含一些非自身編碼的外來基因，其中一些基因可能編碼致病因子，導(dǎo)致人類疾病［8－9］。同時(shí)，分枝桿菌噬菌體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的感染能力與其所屬族群有密切的關(guān)系。某些分枝桿菌噬菌體不能感染結(jié)核分枝桿菌，如K族、A2／A3亞族。因此必須篩選出能感染結(jié)核分枝桿菌且不含致病基因的裂解性噬菌體用于噬菌體療法。

共線性分析顯示，噬菌體Leo基因組與噬菌體BPs及Angel基因組最相似。且系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，噬菌體Leo與噬菌體BO4及DNAⅢ親緣關(guān)系最近，這4株噬菌體均為G簇噬菌體，故考慮Leo為G簇噬菌體。再者，Leo的GC含量66．86%，接近G簇噬菌體的GC含量（66．6%～66．8%），符合不同簇噬菌體之間GC含量差異大，同簇噬菌體的GC含量基本一致的原則，側(cè)面印證Leo為G簇噬菌體［13］。G族噬菌體具有既能感染恥垢分枝桿菌，也能感染結(jié)核分枝桿菌形成噬菌斑的特點(diǎn)［13］。本實(shí)驗(yàn)通過測定噬菌體Leo的宿主譜也證實(shí)，Leo能在不同的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株上形成噬菌斑，它不僅能感染結(jié)核分枝桿菌敏感株、結(jié)核分枝桿菌耐藥株，還能感染非結(jié)核分枝桿菌。對(duì)Leo的編碼基因進(jìn)行逐個(gè)分析，未發(fā)現(xiàn)致病基因及毒力基因，則其滿足噬菌體療法對(duì)噬菌體的安全要求。同時(shí)，由于Leo編碼次要微絲蛋白的基因（gene22）與Halo gene22相似，可通過相應(yīng)的點(diǎn)突變，提高其對(duì)結(jié)核分枝桿菌的感染能力。噬菌體Halo或BPs的突變株對(duì)結(jié)核分支桿菌的感染能力雖強(qiáng)，但這2株噬菌體均為溶源性噬菌體，不能用于結(jié)核病的噬菌體療法。因此，噬菌體Leo是一株極具抗結(jié)核潛力且不含不利基因的裂解性噬菌體。能否通過Leo gene22 604位點(diǎn)或306位點(diǎn)的氨基酸突變，來提高噬菌體感染結(jié)核分枝桿菌的能力尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

因此，噬菌體Leo滿足噬菌體療法對(duì)噬菌體的裂解性及安全性的各項(xiàng)要求，能夠作為“雞尾酒制劑”的候選噬菌體。

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