吳春明，曲振運(yùn)，董安石，李 巖，張宏偉，許友松，李偉華，王 建，李 濤

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)外科, 遼寧 大連 116011； 2.大連醫(yī)科大學(xué) 病理生理學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)

大鼠腦積水及其分流模型建立

吳春明>1，曲振運(yùn)>2，董安石>1，李 巖>1，張宏偉>1，許友松>1，李偉華>1，王 建>1，李 濤>1

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)外科, 遼寧 大連 116011； 2.大連醫(yī)科大學(xué) 病理生理學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

目的建立大鼠腦積水及腦積水分流模型。方法雄性Wistar大鼠80只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各40只，實(shí)驗(yàn)組大鼠應(yīng)用顯微外科技術(shù)，在顯微鏡下向枕大池中注射250 mg/mL高嶺土混懸液0.05 mL，對(duì)照組用同樣方法向枕大池注入生理鹽水0.05 mL，34只完成腦積水模型的實(shí)驗(yàn)組大鼠，再根據(jù)觀察時(shí)間隨機(jī)分成A(3d)、B(1周)、C(3周)、D(3周腦積水模型分流術(shù)后3 d)、E(3周腦積水模型分流術(shù)后1周)組，35只完成腦積水對(duì)照組大鼠，隨機(jī)再根據(jù)觀察時(shí)間分為A1(3d)、B1(1周)、C1(3周)、D1(3周腦積水模型分流術(shù)后3 d)、E1(3周腦積水模型分流術(shù)后1周)組。D、E組在顯微鏡下分別行側(cè)腦室-皮下分流術(shù)， D1、E1組大鼠用和D、E組大鼠相同的方法，只是不放置分流管，通過腦室病理切片, MR觀察腦室系統(tǒng)的變化。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組大鼠腦室隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸擴(kuò)大，腦積水癥狀逐漸加重，分流后腦室隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸縮小，癥狀得到改善。腦織織切片腦室指數(shù)測(cè)定：A組為0.165±0.076，B組0.293±0.096，C組0.487±0.133；對(duì)照組各亞組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)差異無顯著性意義(P>0.05)，平均為0.029±0.010。A、B、C組和A1、B1、C1組比較均P<0.001，A、B、C組間比較P<0.05。D組側(cè)腦室指數(shù)0.322±0.054，E組0.031±0.012，分別與D1、E1組比較，D、E組間比較均P<0.001。結(jié)論高嶺土枕大池注射法制作的大鼠交通性腦積水模型及腦積水腦室-皮下分流術(shù)模型，適用于腦積水發(fā)病機(jī)理及分流術(shù)后腦組織病理改變的實(shí)驗(yàn)研究，對(duì)腦積水病理機(jī)制和治療方法研究有意義。

大鼠；腦積水；分流；模型

腦積水發(fā)病率較高，近年腦室-腹腔分流術(shù)已經(jīng)成為腦積水首選的治療方法之一，治療效果有時(shí)欠佳，其病理機(jī)制不十分清楚，由于腦積水模型尤其是分流模型制作困難，一定程度上制約了腦積水病理改變機(jī)制的研究，本研究組在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，成功制作大鼠腦積水及其分流模型，并取得了較高成功率，報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

80只雄性Wistar大鼠(體重200～250 g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)用隨機(jī)化表法隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(腦積水模型)和對(duì)照組各40只，實(shí)驗(yàn)組34只，對(duì)照組35只完成腦積水模型制作實(shí)驗(yàn)。將成功制作腦積水模型實(shí)驗(yàn)組34只大鼠，再根據(jù)觀察時(shí)間隨機(jī)分成A組(3 d)6只，B組(1周)6只，C組(3周)6只，D 組(3周腦積水模型分流術(shù)后3 d)8只，E組(3周腦積水模型分流術(shù)后1周)8只。將完成腦積水模型實(shí)驗(yàn)對(duì)照組35只大鼠，隨機(jī)再根據(jù)觀察時(shí)間分為A1(3 d)、B1(1周)、C1(3周)、D1(3周腦積水模型分流術(shù)后3 d)、E1(3周腦積水模型分流術(shù)后1周)組，各7只。

1.2 腦積水模型制作

實(shí)驗(yàn)組大鼠經(jīng)10%水合氯醛(28 mg/100 g)腹腔注射麻醉成功后，頭頸背部備皮，消毒。俯臥位固定于前端有一30°角斜坡長(zhǎng)方形木板，頭置于斜坡上，充分暴露頭頸交界處，于交界處縱行切一長(zhǎng)約1 cm切口，在手術(shù)顯微鏡下鈍性分離頸部肌肉，暴露寰枕筋膜，醫(yī)用 0.45 mm頭皮針穿刺寰枕筋膜，出現(xiàn)落空感后立即停止進(jìn)針，緩緩抽出無色澄清腦脊液0.05 mL后，向枕大池內(nèi)緩慢均勻注射250 mg/mL高嶺土混懸液0.05 mL，注射過程不少于3 min，注射后留針2 min，拔針后立即用醫(yī)用耳腦膠封閉針眼，頭皮釘夾閉切口，維持頭低位15～20 min，對(duì)照組用同樣方法向枕大池注入生理鹽水0.05 mL，麻醉清醒后將大鼠放回籠中，每個(gè)籠中放2只大鼠，維持室溫在23～25 ℃，次日給予充足的水和鼠糧，術(shù)后連續(xù)應(yīng)用頭孢唑啉鈉(50 mg/kg)腹腔注射抗炎5 d。

1.3 腦積水分流模型制作

用內(nèi)徑1.0 mm，外徑1.6 mm的聚四氟乙烯管，近端通過加熱形成90°角后，通過注射器向管內(nèi)注射生理鹽水，證實(shí)通暢后，儲(chǔ)存在70%酒精溶液中，作為側(cè)腦室-皮下分流管備用。

D、E組大鼠，10%水合氯醛(28 mg/100 g)腹腔注射麻醉成功后，頭頸背部備皮，消毒，用尖刃刀沿頭部中線切開，在手術(shù)顯微鏡下以矢狀縫旁2 mm冠狀縫前2 mm點(diǎn)為中心，在手術(shù)顯微鏡下，將右側(cè)顱骨鉆一個(gè)直徑約為2 mm的小圓洞，用21G頭皮針直接穿刺硬腦膜后，將事先制備好的腦室-皮下分流管的腦室端經(jīng)皮質(zhì)穿刺側(cè)腦室約4～5 mm深(從顱骨表面計(jì)算)，見分流管內(nèi)有腦脊液流出，用牙科丙烯酸粘固劑固定在顱骨上，遠(yuǎn)端連接一個(gè)硅膠管,保持通暢埋在頸部皮下，使腦脊液自由地排出到皮下，頭皮釘夾閉切口，麻醉清醒后將大鼠放回籠中，每個(gè)籠中放2只大鼠，維持室溫在23～25 ℃，次日給予充足的水和鼠糧。D組6只，E組7只完成分流實(shí)驗(yàn)。D1、E1組大鼠用和D、E組大鼠相同的麻醉和手術(shù)方法處理，只是不放置分流管，D1、E1組7只均完成實(shí)驗(yàn)。手術(shù)后所有參加實(shí)驗(yàn)的大鼠，再次連續(xù)應(yīng)用頭孢唑啉鈉(50 mg/kg)腹腔注射5 d。

1.4 MRI腦室系統(tǒng)檢測(cè)

應(yīng)用常規(guī)顱腦磁共振(GE：Signa MRI 3.0Tesla)掃描檢測(cè)。用10%水合氯醛(28 mg/100 g)腹腔注射將大鼠麻醉，將醫(yī)用膝線圈置于大鼠頭部，行冠狀位的磁共振掃描。掃描條件：T1 FLAIR掃描：采用SE序列參數(shù)：TR:2700,TE:72，F(xiàn)OV:90×90,NEX:1,帶寬：130，矩陣：320×256，層厚：2 mm。T2WI：掃描：采用TSE序列: TR:6000,TE:120，F(xiàn)OV:90×90,NEX:1,帶寬：31.25，矩陣：384×384，層厚：2 mm。各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠MRI檢查，觀察大鼠腦室系統(tǒng)變化。

1.5 腦組織病理標(biāo)本制備

將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)大鼠用10%水合氯醛(28 mg/100 g)經(jīng)腹腔注射深麻醉后，經(jīng)心臟灌注肝素化生理鹽水10 min然后用4%多聚甲醛固定后過夜，用冰凍切片機(jī)將冠狀縫后0.5 mm 冠狀切片，包括腦室周圍區(qū)，切片厚度10 μm，HE染色，4倍顯微鏡下觀察，測(cè)量腦室。在相同的光強(qiáng)度和放大倍數(shù)條件下，取鼠腦冠狀切面第三腦室平面測(cè)腦室大小，測(cè)量側(cè)腦室指數(shù)，計(jì)算腦組織切片的Evan's 比率(側(cè)腦室最大橫徑/同一層面腦組織最大橫徑)作為評(píng)價(jià)腦室大小的指標(biāo)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示， SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，比較采用t檢驗(yàn)的雙總體檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 腦積水和腦積水分流模型成功率

40只雄性Wistar大鼠用于腦積水模型制作，34只完成腦積水造模實(shí)驗(yàn)，1只死于麻醉，5只死于手術(shù)創(chuàng)傷，腦積水模型成功率85%。D、E組分別行側(cè)腦室-皮下分流術(shù)，D組7只，E組6只完成分流實(shí)驗(yàn)全過程，腦積水分流手術(shù)成功率81%，D組手術(shù)創(chuàng)傷致1只大鼠死亡，E組手術(shù)創(chuàng)傷致2只大鼠死亡，其中1只大鼠術(shù)前腦積水反應(yīng)重，狀態(tài)差，術(shù)后第2天死亡。

2.2 腦積水及分流術(shù)后的大鼠癥狀

腦積水造模術(shù)大鼠45 min左右清醒，與平時(shí)無異常。3 d后出現(xiàn)活動(dòng)減少，目光呆滯無神，反應(yīng)遲鈍；1周開始出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、走路不穩(wěn)；3周出現(xiàn)嗜睡狀態(tài)，雙眼球突出明顯，雙眼球周圍可見紅黑色分泌物，弓背、 背部毛豎起，飲食，飲水量均減少。腦積水3周行腦積水分流術(shù)大鼠，分流后3 d，大鼠意識(shí)狀態(tài)由嗜睡變清醒，仍目光呆滯，走路不穩(wěn)明顯改善，飲食，飲水量增加，眼周少量分泌物；分流1周大鼠，意識(shí)、活動(dòng)次數(shù)、走路形態(tài)、 飲食、飲水等與對(duì)應(yīng)點(diǎn)對(duì)照組大鼠無明顯差別。

2.3 MRI檢測(cè)腦室形態(tài)變化

MRI腦室形態(tài)學(xué)變化，對(duì)照組各亞組大鼠側(cè)腦室、三腦室均呈裂隙狀或基本不可見，腦組織亦無水腫；實(shí)驗(yàn)組大鼠均有不同程度的腦室擴(kuò)張，術(shù)后3 d、1周、3周，隨著時(shí)間推移，腦室系統(tǒng)進(jìn)行性擴(kuò)大，大腦皮層受壓變薄。腦積水3周行腦積水分流術(shù)大鼠，術(shù)后3 d、1周，隨著時(shí)間推移，腦室系統(tǒng)逐漸回縮，分流術(shù)后1周，腦室系統(tǒng)恢復(fù)呈裂隙狀或基本不可見，腦皮層有所增厚。見圖1和2。對(duì)照組各組大鼠各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)差異無顯著性意義。見圖3。

圖1 造模后MRI表現(xiàn)

圖2 腦積水分流術(shù)后MRI表現(xiàn)

圖3 對(duì)照組MRI表現(xiàn)

2.4 腦組織切片腦室指數(shù)測(cè)定

腦組織切片測(cè)定對(duì)照組的各亞組大鼠各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)側(cè)腦室指數(shù)，各亞組差異無顯著性意義(P>0.05)，平均為0.029±0.001，實(shí)驗(yàn)組的A、B、C組大鼠腦室進(jìn)行性擴(kuò)大，腦室周圍區(qū)因腦室機(jī)械性擴(kuò)張而縮小，腦積水造模后3 d(A組)，側(cè)腦室指數(shù)0.165±0.076， 1周(B組)擴(kuò)大到0.293±0.096， 3周(C組)0.487±0.133，A、B、C組與A1、B1、C1組比較均P<0.001，A、B、C組間比較P<0.05。3周腦積水大鼠，分流后3 d(D組)側(cè)腦室指數(shù)0.322±0.054，1周(E組)縮小到0.031±0.012，分別與D1組、E1組比較，D組、E組間比較均P<0.001。D、E組與對(duì)照組腦組織切片側(cè)腦室見圖4。

3 討 論

成人正常顱壓腦積水智力改變較早，開始時(shí)呈現(xiàn)近事遺忘，進(jìn)而出現(xiàn)思維與動(dòng)作遲緩，癡呆，走路不穩(wěn)，重者甚至不能行走或站立，出現(xiàn)尿失禁；影像學(xué)上表現(xiàn)為腦室系統(tǒng)普遍增大，腦室和外側(cè)裂擴(kuò)大，腦室擴(kuò)大伴額角圓鈍，海馬形態(tài)和腦溝正常，如果不進(jìn)行及時(shí)治療，腦室系統(tǒng)逐漸擴(kuò)大，皮質(zhì)變薄[1]。目前側(cè)腦室-腹腔分流手術(shù)是臨床治療腦積水首選方法之一，分流術(shù)后，判斷手術(shù)是否成功的重要指標(biāo)之一是觀察病人臨床癥狀是否得到改善，影像學(xué)上，擴(kuò)大的腦室系統(tǒng)是否回縮。本研究參照文獻(xiàn)用大鼠建立的腦積水模型[2-3]，觀察到與成人腦積水患者類似的臨床表現(xiàn)，用大體切片標(biāo)本，對(duì)腦室系統(tǒng)大小測(cè)量，觀察到隨著時(shí)間的推移，腦室系統(tǒng)進(jìn)行性擴(kuò)大，腦積水臨床表現(xiàn)也漸進(jìn)性加重，分流術(shù)后，腦室系統(tǒng)縮小，臨床癥狀也得到改善；影像學(xué)改變，與成人腦積水手術(shù)術(shù)后腦室系統(tǒng)改變相似，分流后腦室系統(tǒng)明顯縮小，所以，本腦積水及分流模型適合成人腦積水及分流術(shù)后機(jī)理變化的研究。

圖4 腦組織切片表現(xiàn)

枕大池注入高嶺土混懸液法是目前應(yīng)用最廣泛的制作交通性腦積水模型的方法。經(jīng)皮切開暴露寰枕筋膜直視下注入高嶺土混懸液較經(jīng)皮盲穿注入高嶺土混懸液大大降低了死亡率，本研究制作的腦積水模型，取得較高的成功率，且此種方法簡(jiǎn)便易行，無需特殊設(shè)備，模型制作穩(wěn)定可靠。本組在制作過程中有如下體會(huì)：(1)動(dòng)物滿意的麻醉非常重要。(2)暴露寰枕筋膜時(shí)，嚴(yán)格沿中線鈍性分離肌肉，這樣既容易分離又對(duì)肌肉損傷小。(3)穿刺抽吸腦脊液時(shí)維持頸部屈曲30°，穿刺角度與水平線成60°～70°角，穿刺有落空感時(shí)立即停止進(jìn)入。抽取腦脊液時(shí)，注射器針頭斜面向上，防止因吸力過大，對(duì)腦干或小腦造成損傷，應(yīng)避免反復(fù)穿刺。(4)注射高嶺土前，務(wù)必再次混勻懸液，吸入1 mL無菌注射器內(nèi)。當(dāng)注射器針尖穿刺進(jìn)入枕大池后使頸部屈曲20°，穿刺角度與水平線成50°～60°角注射高嶺土，可減少高嶺土滲漏。注射器針頭斜面向上，避免高嶺土直接壓迫局部腦干，左手持注射器，右手旋轉(zhuǎn)推進(jìn)注射器內(nèi)芯，旋轉(zhuǎn)2～3圈即可向前推進(jìn)0.05 mL，抽取腦脊液與注射高嶺土?xí)r速度都要慢。(5)拔針后立即用醫(yī)用耳腦膠封閉針眼，防止腦脊液及高嶺土滲漏。(6)應(yīng)用的高嶺土混懸液濃度高劑量低，既能形成腦積水模型又能減少進(jìn)入小腦延髓池的量，避免進(jìn)入液體量過多導(dǎo)致枕骨大孔疝致死。(7)術(shù)后應(yīng)用廣譜抗生素預(yù)防感染。

參照文獻(xiàn)采用腦室-皮下分流代替腦室-腹腔分流[4-5]，顯而易見，腦室-皮下分流比腦室-腹腔分流操作簡(jiǎn)單，由于將分流管末端直接放置皮下，避免了開腹對(duì)大鼠的創(chuàng)傷，簡(jiǎn)化了模型制作，本研究發(fā)現(xiàn)，腦積水腦室-皮下分流術(shù)后，大鼠的癥狀表現(xiàn)和影像學(xué)變化，與成人側(cè)腦室-腹腔分流相似，完全可以滿足腦積水分流術(shù)后腦組織病理機(jī)制變化的研究，值得推薦首先選擇使用。為了進(jìn)一步提高模型的成功率，本研究體會(huì)：(1)穿刺部位，深度一定要準(zhǔn)確，必須確認(rèn)分流管內(nèi)有腦脊液流出。(2)分流管腦室端固定切實(shí)可靠。(3)制作的分流管遠(yuǎn)端連接一個(gè)硅膠管,防止分流管穿破皮膚，引起感染致死或影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

隨著腦積水模型及分流模型制作技巧的掌握，制作方法的改進(jìn)，模型制作逐漸變得簡(jiǎn)單易行，成功率提高，為腦積水的研究提供良好平臺(tái)。

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Establishmentofratmodelofhydrocephalusandshunt

WUChun-ming1，QUZhen-yun2，DONGAn-shi1，LIyan1,ZHANGHong-wei1,XUYou-song1,LIWei-hua1,WANGJian1,LITao1

(1.DepartmentofNeurosurgery,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116011,China;2.DepartmentofPathophysiology,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China)

ObjectiveTo establish a rat hydrocephalus and hydrocephalus shunt model.MethodsEighty Male Wistar rats Were randomly divided into experimental and control groups of 40 each, Experimental rats injected to cisterna magna with 250 mg/mL kaolin suspension 0.05 mL by microsurgical techniques under the microscope,The same way, the control group injected with saline 0.05 mL to cisterna magna, completed the model of hydrocephalus in 34 rats as the experimental group 1, and then randomly divided into A, B, C, D, E group, completed control in 35 rats as the control group 1, and then randomly divided into A1, B1, C1, D1, E1 group, D, E groups were performed under a microscope the lateral ventricles-subcutaneous shunt, the same way, D1, E1 group does not place the shunt tube, The changes was observed in the ventricular system by Ventricle Slice, MR.ResultsVentricle index determination in Brain tissue slices: A group 0.165±0.076,B group 0.293±0.096, C group 0.487±0.133; Subgroups of the control group showed no significant difference at each time point(P>0.05)，An average of 0.029 ± 0.001. Comparison between A、B、C and A1、B1、C1 groups,P< 0.001, Comparison between A,B,C groups ,P< 0.05. D group lateral ventricle index 0.322±0.054，E group 0.031±0.012, Comparison between D,E and D1,E1 groups,P<0.001.ConclusionThe rats communicating hydrocephalus model and hydrocephalus ventricle-subcutaneous shunt model by Kaolin cisterna magna injection, Suitable for hydrocephalus pathogenesis and experimental study of the pathological changes of brain tissue after shunt, It is meaningful for Pathological mechanisms and research of hydrocephalus treatment.

rat; hydrocephalus; shunt; model

10.11724/jdmu.2013.04.03

R651.1+1

A

1671-7295(2013)04-0316-04

吳春明，曲振運(yùn)，董安石，等. 大鼠腦積水及其分流模型建立[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013,35(4)：316-319.

遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20062157)

吳春明(1967-)， 男，遼寧大連人，教授。E-mail: luckywcm@163.com

曲振運(yùn)，副教授。E-mail: quzhenyun@yahoo.com.cn

2013-06-16；

2013-06-29)