高曉東，王秋英，喬旭光，李鋒，唐曉珍

1(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安，271018)

2(山東省科學(xué)技術(shù)干部學(xué)校，山東濟(jì)南，250100)

生姜是我國(guó)的傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)和特色資源之一，在國(guó)際市場(chǎng)上占有非常重要的地位。我國(guó)生姜生產(chǎn)歷史悠久，品質(zhì)優(yōu)良，但其產(chǎn)后加工技術(shù)水平比較低，多以原料的形式參與國(guó)際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)，嚴(yán)重制約了我國(guó)生姜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，迫切需要高附加值的深加工產(chǎn)品來(lái)提升我國(guó)生姜深加工整體技術(shù)水平。

目前，生姜中已研究的主要成分有姜辣素、姜黃素以及生姜蛋白酶。姜辣素是生姜呈多種藥理作用的主要功能因子［1］，能清除自由基、抗氧化、抗突變、抗腫瘤、抗菌、抗病毒和調(diào)節(jié)免疫等功能［2-3］。姜黃素是植物界很稀少的具有二酮的色素，具有降糖、降脂、抗氧化、抗炎、抗癌等藥理作用［4-6］。生姜蛋白酶被認(rèn)為是木瓜蛋白酶家族的新成員［7］，是一種非常有工業(yè)化應(yīng)用前景的蛋白酶，可用于肉類嫩化［8］、酒類澄清［9］，凝乳［10］、大豆分離蛋白［11］等，尤其能特異水解脯氨酸P2位含有脯氨酸的多肽和蛋白質(zhì)，這種對(duì)脯氨酸的特殊親和性使其在生化研究中成為一種很有前途的工具酶［12］。

生姜中各種有效成分具有較高的研究和應(yīng)用價(jià)值，其提取分離的新工藝也不斷發(fā)展，但多數(shù)都只是單獨(dú)提取。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)目前生姜中各種有效成分多為單獨(dú)提取的現(xiàn)狀，在綜合各種生姜有效成分提取方法的基礎(chǔ)上，對(duì)生姜多種有效成分的聯(lián)合提取方法進(jìn)行研究，以確定一次性提取生姜蛋白酶、姜黃素和姜辣素的適宜工藝，從而可充分利用生產(chǎn)原料，降低生產(chǎn)成本和時(shí)間，提高生產(chǎn)效率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

萊蕪大姜:由山東省萊蕪市東興源食品有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)儀器

UV-2501PC型紫外-可見分光光度計(jì)，日本島津公司;BS-150A電子天平，上海友聲衡器有限公司;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇常州國(guó)華電器有限公司;酸度計(jì)，美國(guó)Thermo公司;TDL-5-A離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;SHZ-ⅢD型循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠;85-2型磁力攪拌器，鄭州市亞榮儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)試劑

酪氨酸，無(wú)錫晶海氨基酸有限公司;香草醛，杭州中香化學(xué)有限公司;L-半胱氨酸、酪蛋白，美國(guó)Sigma公司;三氯乙酸，上海山浦化工有限公司;無(wú)水乙醇、NaOH、NaH2PO4、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;Na2HPO4，天津市巴斯夫化工有限公司;H3PO4，上海中秦化學(xué)試劑有限公司;所用試劑均為分析純。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 料液比的選擇

取生姜100 g，用無(wú)水乙醇按料液比 1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5(g∶mL)打漿，低溫靜置冷卻后，離心 5 min(轉(zhuǎn)速3 000 r/min)，測(cè)定上清液中姜辣素與姜黃素的含量和沉淀中生姜蛋白酶的比活力，綜合確定最佳料液比。

1.4.2 上清液的處理

1.4.2.1 旋蒸溫度的選擇

將無(wú)水乙醇打漿后的上清液加入旋蒸瓶，并按照40、50、60、70、80℃的梯度進(jìn)行真空旋蒸，記錄旋蒸時(shí)間，旋蒸后，上相餾分為姜辣素，測(cè)定其Abs 280 nm值，下相固體物為姜黃素，測(cè)定其Abs 425 nm值，確定最佳提取溫度。

1.4.2.2 旋蒸轉(zhuǎn)速的選擇

在1.4.2.1確定的旋蒸溫度下，分別按照16、32、48、64、80 r/min 的轉(zhuǎn)速進(jìn)行真空旋蒸，同樣根據(jù)吸光度值確定旋蒸的最佳轉(zhuǎn)速。

1.4.3 沉淀的處理

1.4.3.1 緩沖液pH值的選擇

離心后的沉淀分別用 pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 的 H3PO4緩沖液(0.05 mol/L，含 5 mmol/L EDTA，15 mmol/L L-Cysteine)按照 1∶4(g∶mL)進(jìn)行復(fù)溶，攪拌混勻后過(guò)濾，棄殘?jiān)羯锨逡?，測(cè)量清液體積，置清液于冰浴中，緩慢加入95%無(wú)水乙醇，使乙醇的終體積分?jǐn)?shù)為60%，于冰浴中靜置沉淀后，抽濾，稱量沉淀質(zhì)量，得濕酶粉。于4℃冰箱保存。測(cè)定酶活時(shí)，以濕酶粉∶∶檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(0.05 mol/L、pH 6.0)=1∶10(g∶mL)的比例混合，待酶粉溶解完全，即得到酶液，根據(jù)比活力確定最佳緩沖液pH值［13］。酶液需現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4.3.2 冰浴時(shí)間的選擇

根據(jù)1.4.3.1中確定的緩沖液pH值，重復(fù)以上操作，于冰浴中分別靜置4、5、6、7、8 h 沉淀后，抽濾，稱量沉淀質(zhì)量，得濕酶粉，根據(jù)比活力確定最佳冰浴時(shí)間。

1.5 測(cè)定方法

1.5.1 生姜蛋白酶比活力的測(cè)定方法［14］

生姜蛋白酶比活力即生姜蛋白酶活力與總蛋白質(zhì)含量的比值，單位U/mg。

1.5.1.1 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用Bradford Protein Assay(考馬斯亮藍(lán)G-250)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度［14］。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=97.142x-1.2932，R2=0.997，其中:x為樣品的吸光度值(Abs 595nm);y為蛋白質(zhì)濃度(μg/mL)。

1.5.1.2 生姜蛋白酶活力測(cè)定

生姜蛋白酶活力的定義:在40℃水浴條件下，酶促反應(yīng)前5 min降解酪蛋白產(chǎn)生TCA(三氯乙酸)可溶的多肽增加量，以活性與滅活的生姜蛋白酶進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)方程，每增加1 μg/mL酪氨酸的值計(jì)量為一個(gè)酶活力單位。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=802.92x-9.5212，R2=0.9995，其中:x為酶促反應(yīng)樣品的吸光度值(Abs 280nm);y為生姜蛋白酶活力值(U)［14］。

1.5.2 姜辣素含量的計(jì)算［15］

準(zhǔn)確配制20 μg/mL的香草醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=12.946x+0.208，R2=0.999 1，其中:x為樣品的吸光度值(Abs 280 nm);y為姜辣素含量(μg/mL)。姜辣素質(zhì)量計(jì)算:

其中:m為姜辣素質(zhì)量(mg);V0為上清液的體積(mL);V1為所取旋蒸液的體積(mL);V2為旋蒸出的姜辣素的體積(mL)。

1.5.3 姜黃素含量的計(jì)算［16］

準(zhǔn)確配制100 μg/mL的姜黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=6.346 9x-0.303，其中:x為樣品的吸光度值(Abs 425 nm);y為姜黃素含量(μg/mL)。姜黃素質(zhì)量計(jì)算:

其中:m為姜黃素質(zhì)量(mg);V0為上清液的體積(mL);V1為所取旋蒸液的體積(mL);V2為加入姜黃素的乙醇的體積(mL)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為3次結(jié)果的平均值。差異分析采用Ducan法進(jìn)行分析比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳料液比的確定

由圖1、圖2可見，當(dāng)料液比小于1∶3(g∶mL)時(shí)，隨著料液比的增加，姜辣素、姜黃素的提取率以及生姜蛋白酶的比活力呈上升趨勢(shì)，原因可能是在溶劑較少的情況下，打漿比較完全，成分溶出較多;而當(dāng)料液比超過(guò)1∶3后，各指標(biāo)隨料液比的增加而降低，這是因?yàn)闊o(wú)水乙醇在打漿過(guò)程中起到沉淀蛋白質(zhì)(包括酶)、浸提姜黃素等脂溶性物質(zhì)的作用，無(wú)水乙醇用量的增加，一方面可以保證細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的溶出，使生姜蛋白酶充分沉淀，另一方面也會(huì)增加生姜蛋白酶變性失活的幾率［13］。料液比為1∶3時(shí)，極顯著(P＜0.01)高于其他料液比，故選為最佳料液比。

圖1 生姜蛋白酶比活力隨料液比的變化Fig.1 Ginger proteas activity with the materials liquid radio changes

圖2 姜辣素、姜黃素質(zhì)量隨料液比的變化Fig.2 Gingerol and Curcumin quality with the material liquid radio changes

2.2 最佳旋蒸溫度的確定

由圖3可以看出，姜辣素、姜黃素的提取率都隨溫度增加而顯著升高(P＜0.05)，60℃時(shí)達(dá)到最高，隨后姜黃素提取率緩慢下降(P＞0.05)，而姜辣素極顯著降低(P＜0.01)，可見最佳旋蒸溫度為60℃。

圖3 旋蒸溫度對(duì)姜辣素、姜黃素質(zhì)量的影響Fig.3 Rotary evaporation temperature of Gingerol and Curcumin quality influence

2.3 最佳轉(zhuǎn)速的確定

根據(jù)圖4所示，姜辣素、姜黃素的提取率隨轉(zhuǎn)速的增加均呈降低趨勢(shì)，可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)速越大，旋蒸時(shí)間越短，收集不充分，導(dǎo)致測(cè)量值有所下降。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)采用N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，最低轉(zhuǎn)速為16 r/min，且在企業(yè)實(shí)際生產(chǎn)中旋轉(zhuǎn)速度越高消耗成本越多，故確定最佳轉(zhuǎn)速為16 r/min。

圖4 旋蒸轉(zhuǎn)速對(duì)姜辣素、姜黃素質(zhì)量的影響Fig.4 Rotary evaporation speed of Gingerol and Curcumin quality influence

2.4 緩沖液pH值對(duì)生姜蛋白酶比活力的影響

由圖5可見，生姜蛋白酶的比活力隨復(fù)溶緩沖液pH值的增加而極顯著升高(P＜0.01)，pH=6.5時(shí)達(dá)到最高，且極顯著高于其他pH值(P＜0.01)，然后隨著pH值的增加逐步降低，這可能是由于磷酸緩沖液復(fù)溶后的pH值過(guò)高或過(guò)低破壞了生姜蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)，并引起酶構(gòu)象的改變，導(dǎo)致酶活力降低［17］。故最佳緩沖液pH值為6.5。

圖5 生姜蛋白酶比活力隨緩沖液pH值的變化Fig.5 Ginger protease activity with buffer solution pH value changes

2.5 冰浴時(shí)間對(duì)生姜蛋白酶比活力的影響

圖6 顯示，當(dāng)冰浴時(shí)間低于5 h時(shí)酶產(chǎn)量很低，冰浴5h時(shí)生姜蛋白酶比活力最高，且顯著高于其他時(shí)間(P＜0.05)，之后呈下降趨勢(shì)。原因可能是由于冰浴過(guò)程中乙醇使蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變或破壞，即蛋白質(zhì)變性，使其理化性質(zhì)改變和生物活性喪失，從而導(dǎo)致酶比活力降低［12］。所以最佳冰浴時(shí)間為5 h。

2.6 正交實(shí)驗(yàn)

圖6 生姜蛋白酶比活力隨冰浴時(shí)間的變化Fig.6 Ginger protease activity with ice bath time changes

2.6.1 生姜蛋白酶L9(34)正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選定生姜蛋白酶比活力正交實(shí)驗(yàn)的因素及水平如表1所示，正交實(shí)驗(yàn)表及結(jié)果如表2所示。

表1 生姜蛋白酶最佳提取方案因素水平表Table 1 The best extraction scheme of Ginger protease factor level table

表2 生姜蛋白酶L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Ginger protease L9(34)orthogonal experimental results

由表2極差分析結(jié)果可知，各因素對(duì)比活力的影響大小依次是A料液比＞D冰浴時(shí)間＞C緩沖液pH，最佳條件為 A2C2D2，即料液比1∶3，緩沖液最佳pH值為6.5，最佳冰浴時(shí)間為7 h，經(jīng)驗(yàn)證生姜蛋白酶的得率為1.376%，比活力可達(dá)4 465 U/mg，大于正交表中最大值4 383 U/mg。

2.6.2 姜辣素、姜黃素L9(34)正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選定姜辣素和姜黃素提取的正交實(shí)驗(yàn)因素及水平如表3，正交實(shí)驗(yàn)表及結(jié)果如表4所示。

表3 姜辣素、姜黃素最佳提取方案因素水平表Table 3 Gingerol and Curcumin extraction scheme factor level table

表4 姜辣素、姜黃素L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Gingerol and Curcumin L9(34)orthogonalexperimental results

由表4極差分析結(jié)果可知，各因素對(duì)提取率影響大小均依次為A料液比＞D'轉(zhuǎn)速＞C'旋蒸溫度，最佳條件為A3C'2D'1，即料液比1∶4，旋蒸溫度60℃，轉(zhuǎn)速16 r/min。在此條件下所得提取液的姜辣素、姜黃素質(zhì)量與表4中實(shí)驗(yàn)9一致，每100 g分別為334.8 mg和409.3 mg，其提取率分別為0.334 8%和0.409 3%。由于姜辣素、姜黃素的R值較小，且生姜蛋白酶的市場(chǎng)價(jià)值與前兩種成分相比更高，綜合考慮實(shí)驗(yàn)結(jié)果最終確定生姜中3種有效成分同步提取的最佳條件為A2C2D2C'2D'1，即料液比1∶3，生姜蛋白酶提取的緩沖液pH為6.5，冰浴時(shí)間7h;姜辣素、姜黃素旋蒸溫度60℃，轉(zhuǎn)速16 r/min。在此條件下姜辣素、姜黃素的提取率分別為0.314 3%、0.388 9%，與最佳條件下提取率無(wú)顯著差異。

3 結(jié)論

生姜中3種有效成分同步提取的最佳條件為A2C2D2C'2D'1，即料液比1∶3(g∶mL)，生姜蛋白酶提取的緩沖液pH值為6.5，冰浴時(shí)間7 h;姜辣素、姜黃素旋蒸溫度60℃，轉(zhuǎn)速16 r/min。此條件下生姜中姜辣素、姜黃素的提取率分別為0.314 3%、0.388 9%;生姜蛋白酶的得率為1.376%，比活力達(dá)到4 465 U/mg。

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