陳玉森，葉乃興，許文耀，劉 威，魏日鳳，劉 偉

(1.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護學(xué)院;2.福建農(nóng)林大學(xué)茶葉科技與經(jīng)濟研究所;3.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建福州350002;4.寧德師范學(xué)院，福建寧德352100)

炭疽菌(Colletotrichum Corda)是一類重要的植物病原菌，其地理分布和寄主范圍廣泛，嚴重危害多種瓜果、蔬菜、林木及藥材等.該屬已被描述的種超過1000個，但不同學(xué)者的劃分標準不同.von Arx［1－3］以形態(tài)學(xué)特征為主要依據(jù)劃分種;Sutton［4］主張加入純培養(yǎng)學(xué)特征;Mordue［5－6］則提出以形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)學(xué)、生理學(xué)、病理學(xué)及地理分布等綜合指標劃分種;von Arx et al［7］和Kendrick［8］強調(diào)全型(holomorph)真菌概念，認為種的劃分應(yīng)建立在有性態(tài)和無性態(tài)的聯(lián)系上，種級鑒定標準應(yīng)以分生孢子和附著胞形態(tài)為主、培養(yǎng)特性為輔、寄主范圍作參考的綜合特征來確定［9］.附著胞是炭疽菌產(chǎn)生的能穿透寄主組織的特殊侵染結(jié)構(gòu)［10］，其形態(tài)特征既然作為種劃分的依據(jù)之一，就有必要了解影響其穩(wěn)定的因素.據(jù)報道，孢子懸浮液pH、水的硬度、葡萄糖和乙烯濃度會影響炭疽菌附著胞的生長發(fā)育［11－14］，其他因素則未明確.因此，本文研究孢子齡、葉汁種類和孢子懸液濃度對炭疽菌孢子萌發(fā)、附著胞形成及形態(tài)的影響，為探明不同菌株附著胞發(fā)育過程中的差異及了解其作為物種鑒定的適用范圍奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 供試菌株

從福州、泉州等地的茉莉、香蕉、番石榴、大豆等22種作物上分離獲得22個炭疽病原菌株，經(jīng)鑒定［12－25］確認后，將各菌株保存在4－8℃冰箱內(nèi)，使用時移入外加4 g·L－1KNO3的PSA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)產(chǎn)孢.

1.2 孢子萌發(fā)形成附著胞過程觀測

用寄主為茉莉的菌齡5 d的炭疽菌孢子，配成4.2×105個·mL－1孢子水懸液，在凹玻片上滴60 μL孢子懸液，置于皿底墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，放在25℃光照培養(yǎng)箱中，經(jīng)12、24、48、72、96 h后分別觀測附著胞大小并統(tǒng)計附著胞率.

1.3 活體寄主上和用寄主汁誘導(dǎo)產(chǎn)生的附著胞形態(tài)特征觀測

將寄主為杧果的炭疽菌孢子用水和杧果汁配成3.4×105個·mL－1孢子懸液.各取60 μL，孢子水懸浮液滴于成熟完好的杧果表面上，孢子果汁懸浮液滴于凹玻片上，25℃、光照下保濕培養(yǎng)12 h，觀察活體寄主上和用寄主汁誘導(dǎo)產(chǎn)生的附著胞形態(tài)特征，測量其大小.果汁制法:杧果25 g，水1000 mL，沸煮30 min后過濾去渣，經(jīng)高壓滅菌后使用.

1.4 不同菌齡孢子萌發(fā)及附著胞觀測

將寄主為茉莉的炭疽菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再將菌齡達5、7、9、11、13、15、17 d的孢子，分別用水和茉莉葉汁配成1.7×105個·mL－1孢子懸液，按1.2方法，觀測并統(tǒng)計25℃下光照12 h后的孢子萌發(fā)率和附著胞率.葉汁制法:茉莉葉片200 g，水1000 mL，沸煮30 min后過濾去渣，經(jīng)高壓滅菌后使用.

1.5 不同種類葉汁孢子懸液附著胞形態(tài)特征觀測

采集杧果、番石榴、茶樹、白菜、枇杷、刺桐、豇豆、煙草、柑橘、甜瓜、桃樹、花生、大豆、紅麻及葡萄的葉片，按1.4方法制成葉汁.將寄主為大豆的炭疽菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d，用以上15種葉汁及水分別配成3.4×105個·mL－1孢子懸液，按1.2方法，觀測并統(tǒng)計25℃下光照12 h后的附著胞形狀和大小、孢子萌發(fā)率、附著胞率.

1.6 不同菌株不同濃度孢子懸液中的孢子萌發(fā)及附著胞觀測

將膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)6個菌株以及殼皮炭疽菌(C.crassipes)、蕓薹炭疽菌(C.higgisianum)、黑線炭疽菌(C.dematium)、豆類炭疽菌(C.truncatum)、毀滅炭疽菌(C.destructivum)各 1 個菌株［12－20］，分別用培養(yǎng)基培養(yǎng)6 d，各菌株孢子用水分別配成 3.4 ×107、3.4 ×106、3.4 ×105、3.4 ×104和 3.4×103個·mL－1等5個梯度懸液.按1.2方法，觀測并統(tǒng)計25℃下光照12 h后各菌株孢子萌發(fā)率和附著胞率.

1.7 不同菌株附著胞形態(tài)特征觀測

將膠孢炭疽菌12個菌株以及辣椒炭疽菌(C.capsici)、殼皮炭疽菌、蕓薹炭疽菌、黑線炭疽菌、豆類炭疽菌、毛豆炭疽菌(C.boninense)、瓜類炭疽菌(C.orbiculare)、葡萄刺盤孢菌(C.ampelinum)、芭蕉炭疽菌(C.musae)和毀滅炭疽菌各1個菌株［12－25］，分別用培養(yǎng)基培養(yǎng)6 d，各菌株孢子分別用水配成3.4×105個·mL－1孢子懸液.按1.2方法，觀測25℃下光照12 h后的附著胞形態(tài)特征.

上述6個試驗所用的水均為無菌水，pH 6.8，每個處理重復(fù)3次.

2 結(jié)果與分析

2.1 寄生于茉莉的炭疽菌孢子萌發(fā)和附著胞形成規(guī)律

結(jié)果(圖1、表1)表明，孢子在水中萌發(fā)產(chǎn)生芽管后，不斷長出分枝，后形成卵形、梨形、姜瓣形等暗褐色的附著胞，胞內(nèi)分布黑色顆粒狀物，邊緣光滑.該菌孢子常形成1個附著胞，但隨水培時間延長，單個孢子可逐漸形成多個附著胞，96 h后可見單個孢子產(chǎn)生7個附著胞且有繼續(xù)增長的趨勢，但附著胞大小均無明顯差異.

圖1 單個孢子產(chǎn)生7個附著胞(400×)Fig.1 Seven appressoria generated from a single spore(400 ×)

表1 寄生于茉莉的炭疽菌孢子形成附著胞的規(guī)律Table 1 Appressorium formation regulation of C.gloeosporioides from Arabian jasmine

2.2 炭疽菌在寄主上與用寄主汁誘導(dǎo)產(chǎn)生的附著胞形態(tài)差異

炭疽菌在活體寄主上與用寄主汁誘導(dǎo)產(chǎn)生的附著胞形態(tài)存在一定差異.寄生于杧果的炭疽菌孢子懸液滴于杧果表面，其發(fā)育的附著胞為卵形、梨形、姜瓣形，暗褐色、灰色，長 ×寬為5.7－11.4(7.9)μm ×5.9－7.5(5.6)μm;用果汁配的孢子懸液，在凹玻片上離體培育，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的附著胞為梨形、卵形、姜瓣形，褐色，長 × 寬為8.4－14.9(9.7)μm ×5.9－8.1(7.2)μm.

2.3 菌齡和寄主葉汁對寄生于茉莉的炭疽菌孢子萌發(fā)及附著胞形成的影響

由表2看出，寄生于茉莉的炭疽菌孢子在水中的萌發(fā)率相對較低，且隨菌齡增大而快速下降;附著胞率則均大于81%，且隨菌齡增大而上升.菌齡5 d的孢子懸液萌發(fā)率達51.7%，附著孢率81.8%，適合于附著孢形態(tài)的觀察.

表2 菌齡和寄主葉汁對孢子萌發(fā)率及附著胞形成率的影響1)Table 2 Effects of spore age and host leaves juice on spore germination rate and appressorium formation rate of C.gloeosporioides

炭疽菌孢子在茉莉葉汁中的萌發(fā)率相對較高;但附著孢率明顯低于水培，菌齡5－7 d的孢子萌發(fā)后未形成附著胞，雖然隨菌齡增大附著胞率上升，但17 d的附著胞率也僅55.0%.這說明營養(yǎng)雖能促進孢子萌發(fā)，但抑制了附著胞的形成，不適合作為附著孢形態(tài)觀察的介質(zhì).這可能與是否需要附著胞作為病菌侵染工具有關(guān)，葉汁中的豐富營養(yǎng)物質(zhì)可供孢子吸收萌發(fā)、菌絲分枝生長，不需要附著胞建立侵染點.

2.4 不同植物葉汁對寄生于大豆的炭疽菌孢子萌發(fā)和附著胞形態(tài)特征的影響

結(jié)果(圖2、表3)表明，與水培相比，白菜、枇杷、花生、甜瓜、豇豆、杧果、桃樹、刺桐及柑橘等9種植物葉汁均能與大豆葉汁一樣促進寄生于大豆的炭疽菌孢子萌發(fā)，同時不同程度地抑制附著胞形成;茶、番石榴、煙草、葡萄等4種植物葉汁對孢子萌發(fā)和附著胞形成有顯著抑制作用，致使孢子不萌發(fā)或萌發(fā)后芽管畸形，不產(chǎn)生附著胞.經(jīng)生物學(xué)統(tǒng)計，寄生于大豆的炭疽菌孢子萌發(fā)率與附著胞率相關(guān)系數(shù)r=0.5311，說明二者間相關(guān)性不顯著.觀測還表明，寄生于大豆的炭疽菌在缺乏營養(yǎng)物質(zhì)的水中形成的附著胞，形態(tài)穩(wěn)定，大小均勻，主要為梨形、卵形，暗褐色，長 × 寬為 7.4－9.9(8.6)μm ×5.3－6.4(5.6)μm.在大豆、白菜等10種供試植物葉汁中該菌附著胞個體相對較大且大小不均一，部分附著胞形態(tài)發(fā)生變異，出現(xiàn)半橢圓形、姜瓣形等，大豆汁、杧果汁誘發(fā)的附著胞較水培顏色淺，為淡褐色(表3).綜合上述試驗結(jié)果，用菌齡5 d的孢子水培誘發(fā)附著孢，萌發(fā)率、附著孢率適中，形態(tài)穩(wěn)定，適合于炭疽菌種的比較鑒定.

圖2 寄主大豆的炭疽菌附著胞形態(tài)(400×)Fig.2 Appressorium morphology of C.truncatum(400 × )

表3 不同植物葉汁對寄生于大豆的炭疽菌附著胞形態(tài)特征的影響1)Table 3 Effects of some plant juices on morphological characteristics of C.truncatum

2.5 不同菌株不同孢子懸液濃度對孢子萌發(fā)和附著胞形成的影響

表4顯示，懸液濃度高時炭疽菌孢子不萌發(fā)或僅極個別萌發(fā)，附著胞率低，甚至為0;隨懸液濃度降低，孢子萌發(fā)率均有不同程度的上升，附著胞率則在懸液濃度為3.4×106個·mL－1時出現(xiàn)一個峰值后下降;懸液濃度低時雖然孢子萌發(fā)率很高，但附著胞率極低.綜合來看，觀測附著胞形態(tài)特征的孢子懸液濃度應(yīng)以3.4 ×105個·mL－1左右為宜.

表4 不同菌株不同孢子懸液濃度對孢子萌發(fā)和附著胞形成的影響1)Table 4 Effects of spore concentrations on conidium germination and appressorium formation

2.6 22株炭疽菌附著胞形態(tài)特征比較

由表5看出，12個膠孢炭疽菌株中，寄主為茉莉、油茶等的11個菌株的附著孢形狀類型和色澤基本相同，在一個視野內(nèi)可見梨形、卵形或姜瓣形等附著胞;各菌株附著胞大小相似;未成熟的附著胞為無色或灰色，成熟時則為暗褐色.這些菌株單憑附著胞形態(tài)難以被區(qū)別開來.寄生于雷公藤的炭疽菌附著胞形狀類型較多，胞內(nèi)灰色顆粒物明顯，周邊粗齒狀，黑褐色，相對容易識別.其他10個菌株產(chǎn)生的附著胞形狀多樣，有姜瓣形、球形、不規(guī)則形、梨形及卵形等，色澤類型也較多，有灰色、褐色、黑色等，胞內(nèi)顆粒物凸出或無，與孢子形態(tài)相結(jié)合，能將菌株初步區(qū)別開來.

表5 22株炭疽菌附著胞形態(tài)特征Table 5 Appressorium morphological characteristics of Colletotrichum species from 22 hosts

3 結(jié)論與討論

5 d菌齡的孢子以水配成3.4×105個·mL－1左右的孢子懸液，在25℃光照下培養(yǎng)12 h，附著胞的形態(tài)特征穩(wěn)定，該條件較適宜孢子萌發(fā)與附著孢的觀察.用該方法誘導(dǎo)22株炭疽菌產(chǎn)生附著孢，對其形態(tài)特征觀察發(fā)現(xiàn)，11種炭疽菌產(chǎn)生的附著胞形態(tài)特征存在一定的差異，與孢子形態(tài)相結(jié)合，能將這些菌株初步區(qū)分出來;膠孢炭疽菌的12個菌株中，除寄生于雷公藤的炭疽菌外，其余11個菌株的附著孢形態(tài)差異不明顯，單憑肉眼觀察難以區(qū)別.Crouch et al［26－27］指出，膠孢炭疽菌復(fù)合類群下包括許多具有明顯系統(tǒng)發(fā)育分化及生理病理特征分化的不同物種，僅根據(jù)形態(tài)和寄主，已經(jīng)不足以準確鑒定種.Damm et al［28］認為，物種鑒定必須是基于基因型與表型相結(jié)合的更為完整而科學(xué)的物種概念.因此，附著胞形態(tài)差異只能作為種間鑒定的依據(jù)之一，通過觀察不同寄主的炭疽菌附著胞形態(tài)更有助于理解其病理特征的分化.

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