張慶波 陳玉嬋 李浩華 潘清靈 王磊 李冬利 陶美華 章衛(wèi)民

（1. 廣東省微生物研究所 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實驗室 廣東省華南應(yīng)用微生物重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，廣州 510070；2. 中國科學(xué)院南海海洋研究所，廣州 510301）

南方紅豆杉（Taxus chinensis var. mairei Cheng et L.K）為紅豆杉屬（Taxus Linn）植物，主要分布于長江流域、南嶺山脈山區(qū)及河南、陜西（秦嶺）、甘肅等省。自紅豆杉中發(fā)現(xiàn)具有獨特抗癌機制的紫杉醇后，人們開始大量從紅豆杉樹皮中提取紫杉醇，致使紅豆杉資源遭到嚴重破壞。為解決紫杉醇的新來源，人們采用了各種不同的方法，并取得了一定的成果。1991年，Christen等通過太平洋紅豆杉（Taxus brevifolia）的組織培養(yǎng)獲得了紫杉醇［1］；1994年，Nicolaou等［2］完成了紫杉醇的全合成。1993年，Stierle等［3］從太平洋紅豆杉樹皮內(nèi)生真菌Taxomyces andreanae的發(fā)酵液中分離得到了紫杉醇，這一發(fā)現(xiàn)使紅豆杉屬植物中內(nèi)生真菌及其次生代謝產(chǎn)物的研究成為熱點，并發(fā)現(xiàn)許多內(nèi)生真菌都能夠產(chǎn)生紫杉醇或具有紫杉醇類似結(jié)構(gòu)的代謝產(chǎn)物［47］。本研究對產(chǎn)自廣東的南方紅豆杉進行內(nèi)生真菌的分離和鑒定，探討南方紅豆杉內(nèi)生真菌的多樣性，并對分離到的內(nèi)生真菌的發(fā)酵粗提物進行體外細胞毒活性研究，旨在篩選出具有良好抗腫瘤活性的菌株，為進一步研究其活性次生代謝產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

南方紅豆杉樣品，包括葉、枝條、果實及樹皮，2008年10月采自廣東省大東山自然保護區(qū)。

Taq酶及其他PCR相關(guān)試劑購于大連寶生物工程有限公司，其他分析純化學(xué)試劑均為市售。

人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞SF-268、人肺癌細胞NCIH460、人乳腺癌細胞MCF-7，均保存于廣東省微生物研究所。

DMI 3000 B倒置顯微鏡（Leica）；S-3000 N掃描電鏡（日立）；EPS 3501電泳儀（Amersham Pharmacia Biotech）； ImageQuant 350 凝膠成像儀；LAMBDA-E酶標儀（Biotech）；2123-2二氧化碳培養(yǎng)箱（Shellab）；Mastercycler gradient 5331 PCR儀（Eppendof）；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；LRH-250生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；THZ-C-1搖床（廣州市正一科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離 將采集的新鮮樣品用流水沖洗，然后用無菌水漂洗2次，放入75%的乙醇中浸泡7 min，取出后用無菌水漂洗3次，再放入0.1%的升汞溶液中浸泡5-7 min，取出后用無菌水漂洗4次。葉片用無菌剪刀剪去邊緣后剪成約0.5 cm×0.5 cm 的方塊；枝條用無菌手術(shù)刀削去四周，取中間部位剪成1 cm長的小段；樹皮用手術(shù)刀去掉外皮層后，剪成0.5 cm×0.5 cm小塊；果實剝?nèi)ネ馄?，取中間部位，剪成小塊。用最后一次漂洗用的無菌水涂板作為陰性對照。處理好的樣品放入事先準備好的PDA平板（含20 μg/mL卡那霉素和20 μg/mL氨芐青霉素）培養(yǎng)基中，26℃恒溫培養(yǎng)，待長出菌絲后，挑取平板中單一菌落進一步純化，純化后的菌株轉(zhuǎn)接到裝有PDA培養(yǎng)基的斜面上，4℃冰箱保存。

1.2.2 內(nèi)生真菌的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 肉眼觀察分離菌株在PDA平板上的培養(yǎng)特征；用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲、孢子、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等形態(tài)特征；用掃描電鏡觀察部分菌株的孢子、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等特征；參考《真菌鑒定手冊》［8］，對分離菌株進行初步鑒定。

掃描電鏡樣品制備和觀察：將PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)7-10 d的培養(yǎng)物連同培養(yǎng)基一起切成0.5 cm× 0.5 cm的小塊，經(jīng)3%戊二醛固定5 h，PBS緩沖鹽洗滌；1%鋨酸固定2 h，PBS緩沖鹽洗滌；乙醇、丙酮脫水后，用乙酸異戊酯置換其中的溶劑（2次）。完全脫水后的樣品臨界點干燥3 h，噴金，掃描電鏡觀察。

1.2.2.2 分子鑒定 總DNA的制備參考王磊等［9］的方法。PCR擴增采用真菌rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA ITS）通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，正向）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，反向）［10］擴增分離菌株的rDNA ITS區(qū)。PCR采用20 μL反應(yīng)體系，通過Ex Taq（TaKa-Ra）進行，反應(yīng)條件為93℃預(yù)變性3 min；93℃變性45 s，55℃復(fù)性45 s，72℃延伸1.5 min，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物利用PCR產(chǎn)物純化試劑盒（QIAGEN）純化，純化后的樣品由廣州景瑞生物科技有限公司進行測序。測序獲得的序列通過BLAST 程序在GenBank上進行相似性序列檢索分析。

1.2.3 細胞毒活性研究

1.2.3.1 發(fā)酵液提取物的制備 從斜面挑取少許菌絲接種到PDA平板上活化3 d，挑取活化后的菌絲（連同培養(yǎng)基）轉(zhuǎn)接到裝有500 mL PD培養(yǎng)基的1 L的三角瓶中，26℃，120 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)物抽濾后，收集濾液，濾液用乙酸乙酯萃取3次，萃取液于40℃下減壓濃縮至干，得到發(fā)酵液粗提物備用。

1.2.3.2 發(fā)酵粗提物的細胞毒活性測定 采用MTT法［11］測定發(fā)酵粗提物對腫瘤細胞SF-268、NCIH460和MCF-7的生長抑制率，各粗提物的作用濃度為100 μg/mL，以順鉑作為陽性對照，作用濃度為20 μg/mL，每處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)生真菌的分離及鑒定

從南方紅豆杉的葉、枝條、樹皮及果實中共分離到內(nèi)生真菌55株，根據(jù)培養(yǎng)特征將這些菌株分成32類，測序后獲得22條不同的序列，將這些序列通過BLAST 程序在GenBank上進行序列相似性檢索分析，結(jié)果見表1。

從表1可以看出，分離菌株中能確定種的有膠孢刺盤孢（Colletotrichum gloeosporioides）、芒果球座菌（Guignardia mangiferae）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、暗色節(jié)菱孢（Arthrinium phaeospermum）和細交鏈孢菌（Alternaria alternata）；確定到屬的有炭角菌屬（Xylaria）、毛殼菌屬（Chaetomium）、擬莖點霉屬（Phomopsis）和長蠕孢屬（Helminthosporium）；只能確定為植物內(nèi)生真菌而未能確定其種屬的有4株；而菌株A213、A220、A239和A241與最相似物種的相似率低，分別為92.1%、94.9%、93.1%和92.3%，有待作進一步鑒定。A213、A220、A239、A241的形態(tài)特征見圖1及表2。

表 1 分離及測序結(jié)果

2.2 內(nèi)生真菌的抗腫瘤活性

除了菌株A229和A232外，對其余20個菌株的發(fā)酵粗提物進行了體外細胞毒活性測試，結(jié)果見表3。從表3中可以看出，有4株內(nèi)生真菌對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞SF-268的抑制率在50%以上，有2株對肺癌細胞NCI-H460的抑制率在50%以上，有6株對乳腺癌細胞MCF-7的抑制率在50%以上，其中菌株A223和A240對MCF-7的抑制率均在90%以上。

圖1 菌株形態(tài)特征

表 2 菌株A213、A220、A239、A241的形態(tài)特征

表3 發(fā)酵粗提物細胞毒活性（作用濃度為100 μg/mL）

3 討論

內(nèi)生真菌在植物體內(nèi)廣泛分布，這種分布既有一定的宿主或組織專一性，又受宿主生長環(huán)境的影響，具有豐富的多樣性。同一植物在不同的地理區(qū)域具有不同的內(nèi)生真菌類群分布［12］。紅豆杉的內(nèi)生真菌多樣性豐富，到目前為止已從紅豆杉屬植物中分離到不少不同種屬的內(nèi)生真菌（表4）。與已報道的南方紅豆杉內(nèi)生真菌比較，本研究首次從生長于廣東地區(qū)的南方紅豆杉中分離獲得了以往未見報道的內(nèi)生真菌，且菌株A213、A220、A239、A241與GenBank中最相似物種的相似率低，是否為新的種屬有待進一步研究。可見，從不同地理區(qū)域的南方紅豆杉中可以獲得不同類群的內(nèi)生真菌資源。

紅豆杉內(nèi)生真菌活性次級代謝產(chǎn)物的研究逐漸被人們所重視，已成為研究抗腫瘤藥物和其他藥物的重要資源。如從太平洋紅豆杉植物內(nèi)生真菌Taxomyces andreanae中分離得到的紫杉醇是一種活性很好的抗微管蛋白聚合的藥物，已經(jīng)被開發(fā)成為抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨床。此外，人們還從紅豆杉屬植物中分離到能夠產(chǎn)生抗腫瘤活性物質(zhì)的其他真菌。如王建鋒［27］等從紅豆杉皮層中分離到一株瘤座孢（Tubercularia sp.），發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液提取物在體外有較強的抗腫瘤活性；李桂玲［16］等從三尖杉、南方紅豆杉及香榧中分離到172株植物內(nèi)生真菌，利用MTT法對其進行活性檢測表明，25株內(nèi)生真菌對KB人口腔上皮癌或HL-60人白血病細胞具有顯著的抑制作用。本研究對20株內(nèi)生真菌發(fā)酵粗提物進行細胞毒活性研究，結(jié)果有6株對至少1種受試腫瘤細胞株的抑制率在50%以上，占受試菌株總數(shù)的30%，其中菌株A223和A240對人乳腺癌細胞MCF-7的抑制率在90%以上，值得對其活性次生代謝產(chǎn)物進行深入研究。

表4 部分南方紅豆杉及其同屬植物中的內(nèi)生真菌

4 結(jié)論

本研究首次從南方紅豆杉中分離獲得了球座菌屬、座腔菌屬、炭角菌屬、節(jié)菱孢屬及長蠕孢屬的內(nèi)生真菌，豐富了南方紅豆杉內(nèi)生真菌的種類和數(shù)量；活性研究發(fā)現(xiàn)部分內(nèi)生真菌的發(fā)酵粗提物具有良好的細胞毒活性。

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