張宏玲 萬駿 嚴(yán)飛 張新勝 曹威 陶偉 黃來強(qiáng)

（1.清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100084；2.清華大學(xué)深圳研究生院生命與健康學(xué)部 生物醫(yī)藥研究中心和基因與抗體治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳 518055）

埃茲蛋白（Ezrin）是一種重要的膜-細(xì)胞骨架連接分子，屬于ERM家族（Ezrin，Radixin，Moesin）中的一員。ERM家族蛋白的同源性主要體現(xiàn)在他們都在N-末端有一個同源性很高的FERM 功能域（FERM domain），以及在C-末端的不同氨基酸位置上有一個關(guān)鍵的、與其激活有關(guān)的蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，F(xiàn)ERM功能域在介導(dǎo)細(xì)胞表面黏附分子與細(xì)胞骨架連接的生理功能中起著關(guān)鍵作用。通過Ezrin的橋接作用，可將肌動蛋白細(xì)胞微絲與細(xì)胞膜相連，從而產(chǎn)生一系列細(xì)胞功能，如細(xì)胞形態(tài)的改變、細(xì)胞運(yùn)動、黏附、有絲分裂、細(xì)胞極性等［1-3］。研究發(fā)現(xiàn)Ezrin在多種腫瘤中表達(dá)異常，并且在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中扮重要角色［4，5］。Ezrin通過調(diào)節(jié)黏附分子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)胞骨架及其相關(guān)蛋白的功能，參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用，從而在腫瘤發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用［6，7］。

研究腫瘤相關(guān)蛋白功能機(jī)理的一個重要方法是通過找出其相互作用的蛋白，進(jìn)而闡述它在整個網(wǎng)絡(luò)狀信號通路中所起的作用。本研究通過原核誘導(dǎo)表達(dá)，純化出Ezrin全長蛋白，便于后續(xù)驗(yàn)證與其相互作用蛋白的體外直接結(jié)合，并通過蛋白免疫動物，獲得針對Ezrin的多克隆抗體，為研究其在真核細(xì)胞以及在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的相關(guān)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒pET-28a（+）-ezrin，重組大腸桿菌E. coli BL21（DE3）［攜帶質(zhì)粒LpET-28a（+）-ezrin］為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存；HeLa，HepG2，HEK 293，CNE，NIH3T3細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室儲存； 用于飼養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的DMEM培養(yǎng)基購自Gibico公司；新西蘭大耳兔、昆明鼠，購買自廣州實(shí)驗(yàn)動物中心；蛋白質(zhì)Marker購自Fermentas；HRP酶標(biāo)二抗（抗鼠和抗兔）及羅丹明標(biāo)記的二抗購自KPL公司。

1.2 方法

1.2.1 Ezrin蛋白原核誘導(dǎo)表達(dá)及純化 隨機(jī)挑取單克隆接種于5 mL含適量抗生素LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min條件下過夜培養(yǎng)。然后按2%接種量接種于200 mL含抗生素新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min條件下繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)菌液濃度達(dá)到OD600=0.6時加入終濃度1 mmol/L IPTG，37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)。IPTG誘導(dǎo)5 h，5 000 r/min 離心5 min，收集菌體，用40 mL 20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）緩沖液混合重懸，冰上進(jìn)行超聲處理。5 000 r/min離心，根據(jù)蛋白表達(dá)情況分別收集上清，沉淀。結(jié)果顯示Ezrin蛋白主要在上清中。

純化方法：Ni-NTA His Binding@Resin 2 mL柱預(yù)處理：用5 mL去離子水洗滌；加0.5-1 mL NiSO4；再用5 mL去離子水洗滌。用10 mL 20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）+8 mol/L尿素平衡柱。上樣準(zhǔn)備好的蛋白上清溶液，收集流出液。用30 mL 20 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L咪 唑、1 mmol/L β-巰 基 乙 醇（pH8.0），收集流出液。用10 mL 20 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L imidazole，1 mmol/L β-巰基乙醇，pH8.0洗脫蛋白，收集1 mL/管，蛋白在此步收集。最后用10 mL 20 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L imidazole，1 mmol/L β-巰基乙醇，pH8.0洗滌，收集流出液。用10 mL去離子水洗滌柱子，充滿20%乙醇，放在4℃冰箱保存。純化的蛋白用SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.2 Ezrin兔抗血清的制備 取2 mL 蛋白（1.6 mg/mL）制品與等體積的弗氏完全佐劑混合，在新西蘭大耳兔背部選取4-6個點(diǎn)，進(jìn)行皮下多點(diǎn)接種，共接種4次，每次間隔14 d，第4次加強(qiáng)免疫后7 d耳緣靜脈采血，分離血清，進(jìn)行效價檢測，獲陽性結(jié)果后，進(jìn)行心臟取血，將血液收集到無菌的試管中，室溫靜置1-2 h，待血液凝固后，轉(zhuǎn)移到4℃冰箱中，放置過夜，至血清析出，將血清轉(zhuǎn)移到無菌的離心管中，10 000 r/min、4℃離心30 min，取上清，保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 Ezrin鼠抗血清制備 5只3-4周齡昆明小鼠，將200 μg抗原蛋白溶于250 μL生理鹽水并與等體積弗氏完全佐劑充分乳化，對小鼠進(jìn)行皮下注射。首次免疫2周后進(jìn)行第2次免疫，免疫原劑量減半，并用弗氏不完全佐劑乳化。第2 次免疫后每隔7 d按照2次免疫的方法繼續(xù)免疫，第4次免疫后第3天，分離血清，進(jìn)行效價檢測，獲陽性結(jié)果后進(jìn)行心臟取血，將血液收集到無菌試管中，室溫靜置1-2 h，待血液凝固后轉(zhuǎn)移到4℃冰箱中，放置過夜，至血清析出，將血清轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，10 000 r/min、4℃離心30 min，取上清，保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 ELISA檢測抗血清效價 抗原包被：將抗原用包被液14 000稀釋（10 μg/mL終濃度），100 μg/孔加入聚苯乙烯96孔反應(yīng)板中，4℃放置過夜。洗滌：次日傾去凹孔內(nèi)的液體，PBST洗3次。封閉：加100 μL/孔3% BSA，室溫放置0.5 h。洗滌：用PBST洗3次。加待測樣品（一抗）：將抗體血清在另一塊板上用PBS連續(xù)稀釋，100 μL/孔加到已包被的板上，每個樣品平行做兩份，免疫前的血清作為陰性對照。加蓋37℃恒溫箱溫育1 h。洗滌：用洗滌液洗3次。加HRP酶標(biāo)二抗：用封閉液1∶8 000稀釋，100 μL/孔，加蓋37℃恒溫箱溫育1 h。洗滌：用PBST洗5次，蒸餾水洗2次。顯色：加新鮮配制的底物溶液100 μL/孔暗處放置5-30 min，顯示藍(lán)色。終止反應(yīng)，比色：加50 μL/孔終止液，顏色變黃；用酶標(biāo)儀測定450 nm處各孔的吸光值，陽性反應(yīng)的最大稀釋度為待測樣品的效價。

1.2.5 Western blotting 檢測 將收集的細(xì)胞加入SDS加樣緩沖液，煮沸10 min，離心后取上清液進(jìn)行SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以5%的脫脂牛奶封閉2 h，與自制兔抗人，鼠抗人TRIP-1的多克隆抗體4℃過夜，之后用TBST每10 min洗1次，共3次；加入相應(yīng)二抗室溫1 h后用TBST洗膜3次，每次10 min，曝光。

1.2.6 細(xì)胞免疫熒光 固定在蓋玻片上的細(xì)胞用PBS漂洗3次，每次5 min；用3.7%的甲醛固定細(xì)胞，37℃ 10 min；0.1% TritonX-100透化10 min；PBS漂洗3次，每次5 min；5%山羊血清（PBS配制）室溫封閉1 h；去除山羊血清封閉液之后，直接加入5% BSA稀釋的一抗，4℃雜交過夜。PBS漂洗5次，每次5 min；加入5% BSA稀釋的二抗，室溫避光雜交1 h；PBS漂洗5次，每次5 min；抗催滅封片劑封片，激光共聚焦熒光顯微鏡上觀察。

1.2.7 Protein G親和層析柱純化抗體 配制緩沖液：起始緩沖液為TBS緩沖液，洗脫緩沖液為pH2.7 0.1 mmol/L甘氨酸鹽酸。

準(zhǔn)備收集管：取1.5 mL離心管，每支離心管加70 μL pH9.0 1 mol/L Tris-HCl。

樣品準(zhǔn)備：抗血清經(jīng)TBS進(jìn)行透析過夜，并經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過。

透析過的待純化的樣品15-25 mL上柱，流速為0.5 mL/min，將留出的樣品反復(fù)過柱。然后以同樣的流速用10-20倍體積的TBS緩沖液洗滌，去除未結(jié)合和非特異性結(jié)合的蛋白，洗滌是否完全可以通過測定OD280的吸光度進(jìn)行。洗脫緩沖液（pH2.7，0.1 mmol/L甘氨酸鹽酸）6-7 mL每管1 mL收集洗脫液，測每管OD280吸收值。收集第2洗脫峰，BCA法測蛋白含量，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

純化的抗體用SDS-PAGE電泳鑒定其純度：用12%分離膠、5%濃縮膠，恒流下電泳2 h，考馬斯亮藍(lán)R250（Pharmacia）染色。

2 結(jié)果

2.1 Ezrin蛋白的表達(dá)與純化

利用構(gòu)建好的pET-28a（+）-ezrin載體分別轉(zhuǎn)化E. coli BL21（DE3），成功地原核誘導(dǎo)表達(dá)Ezrin全長蛋白于上清，并且用經(jīng)鎳柱純化好的蛋白進(jìn)行下一步試驗(yàn)，即免疫小鼠和新西蘭大耳兔。

2.2 Ezrin抗血清效價檢測

將用Ezrin蛋白抗原免疫4次之后的新西蘭大耳兔以及昆明鼠抽取血清樣本通過ELISA法測量抗體效價，計算陽性血清和陰性血清A450值之比（antiserum/preimmune serum，a/p），當(dāng)a/p≥2.1時為陽性，當(dāng)1.5≤a/p＜2.1時為可疑，當(dāng)a/p＜1.5時為陰性。抗血清效價測定，經(jīng)過免疫過的兔和鼠的血清，通過ELISA法測定其效價，如圖2所示，兩種抗血清稀釋倍數(shù)為106時，和陰性血清相比，仍呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，表明免疫后的兩種抗血清的效價均達(dá)到106。

2.3 利用抗體檢測真核細(xì)胞及組織蛋白表達(dá)情況

利用抗體檢測真核細(xì)胞及組織蛋白表達(dá)情況，各細(xì)胞及組織蛋白，12%蛋白膠PAGE電泳，將制作好的Ezrin鼠源及兔源抗體用于Western blotting試驗(yàn)，檢測多種細(xì)胞和組織當(dāng)中的Ezrin表達(dá)情況。將所制備抗體3 000倍稀釋用來檢測真核細(xì)胞內(nèi)源性Ezrin蛋白表達(dá)情況，如圖3所示，兔抗和鼠抗均能夠很好的檢測真核細(xì)胞內(nèi)源性的蛋白表達(dá)，包括293、HeLa、CNE及NIH3T3細(xì)胞株。在HepG2細(xì)胞中，沒有檢測到Ezrin蛋白的表達(dá)。以上結(jié)果說明制備的抗血清具有較高的特異性和靈敏性。

2.4 細(xì)胞免疫熒光法檢Ezrin蛋白細(xì)胞內(nèi)定位

取HeLa細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光，用Ezrin鼠抗來檢測其在細(xì)胞內(nèi)的定位情況，二抗rhodamine標(biāo)記的羊抗鼠抗體。熒光顯微鏡下拍照。將制備的Ezrin鼠抗人多克隆抗體100倍稀釋進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色試驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)制備的抗體能夠進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色，且染色效果十分良好，同時發(fā)現(xiàn)，Ezrin蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)位置定位明顯，此定位與發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)吻合（圖4）。

2.5 Ezrin抗體純化

取免疫過的兔和鼠的抗血清，利用protein G純化方法，將2種抗體進(jìn)行了初步純化，從純化結(jié)果（圖5）可清楚的看到抗體重鏈（55 kD）和輕鏈（26 kD），但是純化得率較低，且有雜帶。其原因可能是抗血清中的抗體亞型與protein G柱子結(jié)合能力較低，或者洗脫緩沖液的pH值需要改進(jìn)和調(diào)整。

3 討論

Ezrin是屬于ERM家族蛋白中與腫瘤密切相關(guān)的蛋白，它在多種癌癥組織中高表達(dá)且對腫瘤細(xì)胞的遷移起著重要的調(diào)控作用。對其功能的研究將進(jìn)一步揭示癌癥發(fā)生發(fā)展的機(jī)理并有望找到治療癌癥的新靶點(diǎn)。本試驗(yàn)中原核表達(dá)純化出的Ezrin蛋白也可以直接用于驗(yàn)證相互作用和體外蛋白活性的試驗(yàn)，為揭示與Ezrin相互作用的蛋白創(chuàng)造條件?？贵w是研究基因功能的重要工具［8-11］。制備一種效價高、特異性好的抗體是研究疾病相關(guān)基因的表達(dá)、定位和生物學(xué)功能非常重要的一步。抗體包括多克隆抗體，單克隆抗體等。單克隆抗體的特異性較好，但制作過程比較繁瑣。多克隆抗體則制作較為容易。本研究通過原核誘導(dǎo)表達(dá)與純化［12］，得到較為純凈的Ezrin蛋白，采用直接免疫兔子和小鼠的方法獲得抗血清。兔抗和鼠抗均能夠很好的檢測真核細(xì)胞內(nèi)源性的蛋白表達(dá)，包括293、HeLa、CNE及NIH3T3細(xì)胞株。在HepG2細(xì)胞中，沒有檢測到Ezrin蛋白的表達(dá)，這與文獻(xiàn)報道相符。曾有文獻(xiàn)報道在HepG2細(xì)胞株當(dāng)中，Ezrin的表達(dá)量很少［13］。ELISA是檢測抗體質(zhì)量相關(guān)系數(shù)的重要手段［14，15］，本研究制備的抗血清經(jīng)過ELISA測定具有較高的效價。未經(jīng)純化的抗血清效價非常高，稀釋很高的倍數(shù)仍可用于Western blotting和免疫熒光等試驗(yàn)，表明制備的抗血清可用于多種免疫學(xué)試驗(yàn)，且有較高的特異性和靈敏度。

抗血清純化可使用幾種不同的方法，常用的是蛋白A/G結(jié)合法和抗原親和純化法［16，17］。為了進(jìn)一步提高抗體的純度，采用protein G方法對抗體進(jìn)行了純化，但純化效率有待提高。分析原因可能是抗血清中的種屬亞型與protein G的結(jié)合能力較弱，或者洗脫緩沖液的pH值需要進(jìn)一步調(diào)整和優(yōu)化。

綜上所述，本研究制備的Ezrin多克隆抗體具有與其抗原特異性結(jié)合的特征，并成功應(yīng)用于ELISA，免疫印跡和免疫熒光試驗(yàn)，其純化方法仍需進(jìn)一步改進(jìn)。這為繼續(xù)深入研究此蛋白的病理、生理學(xué)功能及其調(diào)控打下了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

通過將原核表達(dá)純化，獲得了較為純凈的Ezrin全長蛋白。通過免疫新西蘭大耳兔和昆明小鼠，獲得了抗血清。通過ELISA，Western blotting和免疫熒光試驗(yàn)驗(yàn)證了抗體的效價和特異性，證明用該方法可制備具有較高特異性和靈敏度的多克隆抗體。

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