孫紅娟 周遵春 崔軍 王秀利

（1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，大連 116023； 2.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院 遼寧省海洋水產(chǎn)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116023）

動(dòng)物界中有大約80%的動(dòng)物，共25個(gè)門(mén)類(lèi)生活在海洋中。對(duì)海洋低等無(wú)脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)的研究有助于人類(lèi)探索先天性免疫系統(tǒng)的起源，對(duì)硬骨魚(yú)免疫系統(tǒng)的研究可以展現(xiàn)脊椎動(dòng)物先天性免疫系統(tǒng)的進(jìn)化途徑。先天性免疫系統(tǒng)作為機(jī)體的第一道防線(xiàn)，主要通過(guò)細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體（Pattern recognition receptor，PRR）特異地識(shí)別病原相關(guān)分子模式（Pathogen-associated molecular pattern，PAMP）。例如，蛋白、糖類(lèi)、脂質(zhì)、核酸及這些生物大分子的衍生物［1］。TLR是一個(gè)在進(jìn)化上高度保守的免疫受體家族，屬于I型跨膜蛋白，主要由胞外區(qū)，跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)組成。TLR胞外區(qū)是由亮氨酸重復(fù)序列（Leucine-rich repeat，LRR）形成的螺線(xiàn)管狀結(jié)構(gòu)，根據(jù)LRRs結(jié)構(gòu)差異可以將TLR分為：脊椎動(dòng)物類(lèi)TLR（Vertebrate-like TLR，V-TLR）和原口動(dòng)物類(lèi)TLR（Protostome-like TLR，P-TLR）（圖1）。包括后口動(dòng)物在內(nèi)的V-TLR胞外區(qū)含有一組“LRRNTLRRs-LRRCT”（N-terminal LRR，LRRNT； C-terminal LRR，LRRCT）序列，P-TLR 胞外區(qū)含有一組額外的LRRCT-LRRNT基序［2，3］。TLR胞質(zhì)區(qū)是一個(gè)與IL-1（Interleukin-1）受體家族具有高度同源性的TIR（TLR and IL-1 receptor domain）結(jié)構(gòu)，能夠募集含有TIR結(jié)構(gòu)的接頭蛋白參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了5種接頭蛋白包括：MyD88（Myeloid differentiation primary response gene 88）、MAL（MyD88 adaptorlike）、TRIF（TIR-domain containing adaptor inducing IFN-β）、TRAM（TRIF related adaptor molecule）和SARM（Sterile α- and armadillo-motif-containing protein），表明機(jī)體在受到病原體刺激后會(huì)產(chǎn)生與特定接頭蛋白相對(duì)應(yīng)的免疫應(yīng)答［4］。TLR信號(hào)途徑主要是MyD88依賴(lài)途徑，由胞內(nèi)接頭蛋白MyD88介導(dǎo)，下 游 的IRAK（IL-1 receptor associated kinase）和TRAF（TNF receptor associated factor）依次參與到信號(hào)傳遞過(guò)程，最后NF-кB（Nuclear factor Kappa B）因子被激活而產(chǎn)生免疫應(yīng)答。另一種是針對(duì)TLR3和TLR4的MyD88非依賴(lài)途徑，這兩個(gè)受體能通過(guò)TRIF進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。TLR3能和TRIF直接接觸，而TLR4通過(guò)TRAM將信號(hào)傳遞給TRIF，最終都激活轉(zhuǎn)錄因子IRF（Interferon regulatory factor）［5，6］（圖2）。

第一個(gè)Toll蛋白是在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，其不僅對(duì)果蠅生長(zhǎng)發(fā)育具有調(diào)控作用，還參與免疫反應(yīng)［7］。隨后在人體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了TLR［8］，研究熱點(diǎn)迅速轉(zhuǎn)向了哺乳動(dòng)物。到目前為止，從最原始的后生動(dòng)物海綿到高等的鳥(niǎo)類(lèi)，共在59個(gè)物種中發(fā)現(xiàn)了TLR［9］，其中脊椎動(dòng)物體內(nèi)至少存在23種TLRs。為闡明脊椎動(dòng)物TLR的起源，對(duì)占據(jù)過(guò)渡地位的棘皮動(dòng)物、頭索動(dòng)物、尾索動(dòng)物和無(wú)頜脊椎動(dòng)物TLR的研究是至關(guān)重要的。本文按照海洋動(dòng)物由低到高的進(jìn)化順序?qū)LR及其信號(hào)通路相關(guān)分子進(jìn)行介紹（表1），并對(duì)TLR基因在進(jìn)化過(guò)程中表現(xiàn)出的結(jié)構(gòu)變化和多態(tài)性進(jìn)行探討。

圖1 TLR的兩種結(jié)構(gòu)類(lèi)型［2］

圖2 TLR信號(hào)通路［6］

1 不同海洋動(dòng)物中TLR及其信號(hào)通路分子

1.1 海綿動(dòng)物

海綿動(dòng)物代表著最原始的后生動(dòng)物類(lèi)群，是研究先天性免疫系統(tǒng)起源的理想對(duì)象。早在1907年，Wilson［10］研究發(fā)現(xiàn)，硅質(zhì)海綿（Siliceous sponge）可以識(shí)別非己成分，并且體內(nèi)存在大量免疫分子。近年來(lái)對(duì)尋常海綿綱中兩個(gè)物種TLR的研究為揭示后生動(dòng)物TLR家族的起源具有重要意義。

表1 海洋動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)的TLR及信號(hào)通路分子

2007年，Wiens等［11］在居蟹皮海綿（Suberites domuncula）體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了3個(gè)和脊椎動(dòng)物高度同源的免疫應(yīng)答元件：類(lèi)TLR、IRAK4和細(xì)胞凋亡蛋白。類(lèi)TLR的胞外區(qū)仍沒(méi)有明顯的LRRs結(jié)構(gòu)，TIR區(qū)和脊椎動(dòng)物表現(xiàn)出高度的同源性，推測(cè)居蟹皮海綿體內(nèi)的類(lèi)TLR只是脊椎動(dòng)物TLR的一部分。在受到LPS刺激后，居蟹皮海綿細(xì)胞表面特有的LIP（LPS-interacting protein）可以識(shí)別LPS（Lipopolysaccharide）與MyD88結(jié)合啟動(dòng)下游信號(hào)途徑。2010年，Srivastava等［12］構(gòu)建了澳大利亞大堡礁海綿（Amphimedon queenslandica）的基因組草圖。盡管沒(méi)有檢測(cè)到TLR，但是發(fā)現(xiàn)兩個(gè)含有TIR區(qū)的受體以及TLR信號(hào)通路中的MyD88和Tollip（Toll interacting protein）。這4個(gè)蛋白在胚胎時(shí)期和幼蟲(chóng)時(shí)期的動(dòng)態(tài)表達(dá)說(shuō)明它們參與了發(fā)育和免疫過(guò)程［13］。

1.2 刺胞動(dòng)物

刺胞動(dòng)物又叫腔腸動(dòng)物，包括海蜇、水螅、海葵、珊瑚等。它和兩側(cè)對(duì)稱(chēng)動(dòng)物處于平行的進(jìn)化分支上，是研究?jī)蓚?cè)對(duì)稱(chēng)動(dòng)物免疫系統(tǒng)起源的重要參考模型。目前已經(jīng)完成對(duì)大乳頭水螅（Hydra magnipapillata）、星?？∟ematostella vectensis）和指軸孔珊瑚（Acropora digitifera）的基因組測(cè)序。刺胞動(dòng)物的形態(tài)結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，但它們的免疫系統(tǒng)仍包含著復(fù)雜的信息。在星海葵和指軸孔珊瑚中發(fā)現(xiàn)了TLR以及胞內(nèi)信號(hào)通路成分NF-κB［14］。雖然在大乳頭水螅體內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)典型的TLR以及NF-κB ，但是鑒定得到一個(gè)Rel的同源物和4種含有TIR區(qū)的蛋白，功能研究表明它們都參與免疫應(yīng)答［15］。通過(guò)3種刺胞動(dòng)物體內(nèi)TLR、IL-1受體以及只含有TIR區(qū)蛋白的結(jié)構(gòu)比對(duì)發(fā)現(xiàn)它們?cè)谥篙S孔珊瑚體內(nèi)要比星?？痛笕轭^水螅中的復(fù)雜［16］。

1.3 軟體動(dòng)物

軟體動(dòng)物處于原口動(dòng)物進(jìn)化的初始階段，以貝類(lèi)為主。免疫學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)雙殼類(lèi)體內(nèi)存在保守的進(jìn)化途徑，基因多態(tài)性和基因丟失幾率相對(duì)較低，適于研究原口動(dòng)物免疫系統(tǒng)的起源和進(jìn)化。目前已經(jīng)完成了太平洋長(zhǎng)牡蠣（Crassostrea gigas）、蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）和貽貝（Mytilus edulis）這3種雙殼類(lèi)動(dòng)物的大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并對(duì)地中海貽貝（Mytilus galloprovincialis）數(shù)據(jù)庫(kù)中免疫相關(guān)基因進(jìn)行了系統(tǒng)分析。在太平洋長(zhǎng)牡蠣［17］、蝦夷扇貝［18］和地中海貽貝［19］中都已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)TLR片段，然而在貽貝體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了27個(gè)可能編碼TLR的基因，其中有8個(gè)可翻譯成具有完整的TLR結(jié)構(gòu)的蛋白［20］。這一結(jié)果表明在雙殼類(lèi)體內(nèi)存在著復(fù)雜的先天性免疫系統(tǒng)。

另外，在櫛孔扇貝（Chlamys farreri）體內(nèi)鑒定到一個(gè)Toll（CfToll-1）和TLR信號(hào)通路的4個(gè)關(guān)鍵基因，即MyD88、TRAF6、IкB（Inhibitor of Kappa B）和NF-кB。經(jīng)過(guò)LPS刺激后，它們的表達(dá)量都上升。這些結(jié)果表明，櫛孔扇貝體內(nèi)存在保守的MyD88依賴(lài)途徑，可以激活下游抗氧化、抗菌和細(xì)胞凋亡等反應(yīng)［21］。在太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）體內(nèi)除了克隆到一個(gè)全長(zhǎng)Toll（CgToll-1），還發(fā)現(xiàn)了5個(gè)信號(hào)通路的核心基因，即MyD88、IRAK、TRAF6、IкB和Rel［22］。

1.4 海洋節(jié)肢動(dòng)物

節(jié)肢動(dòng)物門(mén)是動(dòng)物界中最大的一個(gè)門(mén)，鱟和蝦是海洋節(jié)肢動(dòng)物免疫學(xué)研究的重點(diǎn)對(duì)象。

在中華鱟（Tachypleus tridentatus）血細(xì)胞中鑒定到的Toll和果蠅Toll的同源性最高，胞外域LRR上沒(méi)有明顯的PAMP結(jié)合位點(diǎn)，也沒(méi)有組織表達(dá)特異性。這些結(jié)果表明顆粒狀血細(xì)胞表面的Toll不具有識(shí)別LPS的功能［23］。隨后在圓尾鱟（Carcinoscorpius rotundicauda）體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了TLR的接頭分子SARM，在結(jié)構(gòu)上和人體中SARM具有同源性［24］。到目前為止，在對(duì)蝦中已經(jīng)鑒定到6個(gè)TLR，其中3個(gè)都是在南美白對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）中發(fā)現(xiàn)的，分別命名為L(zhǎng)vToll、LvToll2和LvToll3［25］。最先發(fā)現(xiàn)的LvToll具有P-TLR的典型結(jié)構(gòu)。在受到溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）刺激后，3個(gè)基因的表達(dá)量發(fā)生了變化，推測(cè)它們具有免疫功能。第四個(gè)TLR基因是在斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）鰓的cDNA文庫(kù)中檢測(cè)到的，不具有組織表達(dá)特異性［26］。在中國(guó)對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensis）和日本囊對(duì)蝦（Marsupenaeus japonicus）體內(nèi)分別發(fā)現(xiàn)了一個(gè)Toll基因［27，28］，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和表達(dá)規(guī)律上與南美白對(duì)蝦中的Tolls相似。最近在斑節(jié)對(duì)蝦中又克隆得到一個(gè)Toll，它比第一次克隆到的Toll序列長(zhǎng)［29］。

1.5 棘皮動(dòng)物

棘皮動(dòng)物是后口動(dòng)物中進(jìn)化地位最高的無(wú)脊椎動(dòng)物，位于無(wú)脊椎動(dòng)物與脊椎動(dòng)物進(jìn)化分支階段，是研究?jī)蓚?cè)對(duì)稱(chēng)動(dòng)物TLR進(jìn)化過(guò)程中的重要物種。

海膽屬于棘皮動(dòng)物海膽綱，是組織胚胎學(xué)研究領(lǐng)域的模式生物。2006年完成了對(duì)紫海膽（Strongylocentrotus purpuratus）基因組的測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了222個(gè)TLR基因（214個(gè)V-TLR和8個(gè)P-TLR），同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了26個(gè)編碼TLR接頭蛋白的基因［30］。仿刺參（Apostichopus japonicus）屬于棘皮動(dòng)物中的海參綱，與海膽綱處于平行的進(jìn)化分支。對(duì)仿刺參免疫基因的深入研究［31-34］有助于揭示棘皮動(dòng)物先天性免疫系統(tǒng)的多態(tài)性。通過(guò)對(duì)仿刺參的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，將為遺傳和基因組學(xué)研究提供更多信息［35，36］。在本實(shí)驗(yàn)室的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了一些TLR片段，并且首次克隆得到兩個(gè)TLR的cDNA全長(zhǎng)，同時(shí)仿刺參體內(nèi)也存在保守的MyD88信號(hào)通路成分（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。

1.6 頭索動(dòng)物

脊索動(dòng)物門(mén)是動(dòng)物界最高等的門(mén)，共分為3個(gè)亞門(mén)：尾索動(dòng)物亞門(mén)、頭索動(dòng)物亞門(mén)和脊椎動(dòng)物亞門(mén)。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明頭索動(dòng)物是現(xiàn)存最古老的脊索動(dòng)物，代表動(dòng)物是文昌魚(yú)［37］。2003年，美國(guó)文昌魚(yú)（Branchiostoma floridae）的基因組草圖繪制完成，檢測(cè)到48個(gè)完整的TLR基因，由36個(gè)V-TLRs和12個(gè)P-TLRs組成［2］。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)了40個(gè)含有TIR接頭蛋白，包括MyD88、SARM、TIRAP和TICAM2等。根據(jù)TIR區(qū)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)發(fā)現(xiàn)文昌魚(yú)TLR主要分為3大類(lèi)：一類(lèi)和昆蟲(chóng)的V-TLR聚集在一起；另外兩類(lèi)和脊椎動(dòng)物的TLR11家族聚集在一起。2009年，元少春等［38］在青島文昌魚(yú)（Branchiostoma belcheri tsingtauense）中 克 隆 到1個(gè)TLR（bbtTLR）和1個(gè)MyD88（bbtMyD88）。免疫刺激試驗(yàn)結(jié)果顯示，bbtTLRl具有免疫功能，與bbtMyD88一起構(gòu)成一條保守的信號(hào)途徑。另外研究表明，青島文昌魚(yú)中的SARM對(duì)該TLR通路起到負(fù)調(diào)控作用［39］。

1.7 尾索動(dòng)物

尾索動(dòng)物是現(xiàn)存的和脊椎動(dòng)物親緣關(guān)系最近的物種，通過(guò)對(duì)其TLR分析有助于揭示脊椎動(dòng)物TLR起源。玻璃海鞘作為尾索動(dòng)物門(mén)的代表動(dòng)物，它具有發(fā)育調(diào)控系統(tǒng)、神經(jīng)肽和內(nèi)分泌系統(tǒng)，已經(jīng)成為免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)。對(duì)玻璃海鞘（Ciona intestinalis）基因組進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)了3個(gè)TLR基因，以及參與TLR信號(hào)通路的MyD88、IRAK、TRAF、NF-κB和IκB［40］。目前已經(jīng)在玻璃海鞘體內(nèi)克隆得到兩個(gè)TLR的cDNA全長(zhǎng)（CiTLR1和CiTLR2）。它們具有典型的TLR結(jié)構(gòu)，在玻璃海鞘細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中都發(fā)現(xiàn)了這兩個(gè)基因，其病原體的識(shí)別機(jī)制和脊椎動(dòng)物相似［41］。

1.8 無(wú)頜脊椎動(dòng)物

脊椎動(dòng)物亞門(mén)包括無(wú)頜總綱和有頜下門(mén)。七鰓鰻屬于無(wú)頜脊椎動(dòng)物，是最原始的脊椎動(dòng)物類(lèi)群，已經(jīng)表現(xiàn)出適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的一些特征。2007年，在日本七鰓鰻（Lampetra japonica）中首次鑒定出兩個(gè)TLR：TLR14a和TLR14b［42］。隨后，在海七鰓鰻（Petromyzon marinus）基因組最新拼接結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了16個(gè)TLR基因，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析表明海七鰓鰻的TLRs是由魚(yú)類(lèi)TLRs和哺乳動(dòng)物TLRs組成，同時(shí)還鑒定得到了TLR信號(hào)通路下游的MyD88、TICAM和SARM［43］。盡管海七鰓鰻體內(nèi)含有適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，但是主要是通過(guò)先天性免疫系統(tǒng)中TLR來(lái)應(yīng)對(duì)病原體入侵。

1.9 軟骨魚(yú)

軟骨魚(yú)綱屬于脊椎動(dòng)物亞門(mén)，處在銜接無(wú)頜類(lèi)和有頜類(lèi)的過(guò)渡地位，成為研究脊椎動(dòng)物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)起源和進(jìn)化的重點(diǎn)對(duì)象。在軟骨魚(yú)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了具有適應(yīng)性免疫特征的細(xì)胞因子及其受體，如IL-1、IL-8、IL-1R（Interleukin-1 receptor）等［44］。同時(shí)對(duì)于軟骨魚(yú)先天性免疫系統(tǒng)的研究也取得了一定的進(jìn)展，在大象鯊魚(yú)（Callorhinchus milii）基因組中發(fā)現(xiàn)了TLR信號(hào)通路中的相關(guān)成分：TICAM（Toll-like receptor adapter molecule）和TIRAP（TIR domain containing adapter protein）。和其它物種TLR信號(hào)通路中的接頭分子TICAM-1/2和接頭蛋白TIRAP比對(duì)發(fā)現(xiàn)大象鯊魚(yú)是非哺乳動(dòng)物中唯一一個(gè)含有TICAM-2 基因的［45］。

1.10 硬骨魚(yú)

硬骨魚(yú)是水生脊椎動(dòng)物中進(jìn)化最成功的，被稱(chēng)為地球上的水域征服者。目前已經(jīng)完成了對(duì)紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）、墨綠凹鼻鲀（Tetraodon nigroviridis）、斑馬魚(yú)（Danio rerio）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、青鳉（Oryzias latipes）、大西洋鮭（Salmo salar）和三刺魚(yú)（Gasterosteus aculeatus）的大規(guī)?；蚪M或轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)硬骨魚(yú)TLRs以及信號(hào)通路的成分和哺乳動(dòng)物的TLR系統(tǒng)同源性較高［9］。近年來(lái)對(duì)斑馬魚(yú)和紅鰭東方鲀的TLR研究比較深入，分別發(fā)現(xiàn)了14種［46］和12種TLR基因［47］。非哺乳動(dòng)物類(lèi)的TLR14、TLR21和TLR22在兩種魚(yú)中都存在。TLR4b、TLR19和TLR20只存在于斑馬魚(yú)中，而可溶性TLR5（soluble TLR5，TLR5s）和TLR23只出現(xiàn)在紅鰭東方鲀中。目前已經(jīng)在31種魚(yú)類(lèi)中發(fā)現(xiàn)了16種TLRs，有8種是魚(yú)類(lèi)特有的。通過(guò)序列相似性比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果將魚(yú)類(lèi)TLRs分為8個(gè)家族［48］。

2 TLR基因結(jié)構(gòu)域混編

通過(guò)對(duì)海洋動(dòng)物基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，大量只含有LRR區(qū)或TIR區(qū)的序列被發(fā)現(xiàn)。要闡明TLR的起源和進(jìn)化，首先要解決的問(wèn)題是：TLR結(jié)構(gòu)中TIR區(qū)和LRR區(qū)哪個(gè)先出現(xiàn)；兩個(gè)結(jié)構(gòu)何時(shí)結(jié)合在一起形成功能性的TLR；它們的結(jié)構(gòu)在進(jìn)化過(guò)程發(fā)生了怎樣的變化。通過(guò)對(duì)最原始后生動(dòng)物體內(nèi)TLRs、LRRs和TIRs序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，刺胞動(dòng)物中出現(xiàn)了脊椎動(dòng)物類(lèi)TIR（Vertebrate-like TIR，V-TIR）和 原口動(dòng)物類(lèi)Toll（Protostome-like Toll，P-Toll）［14］，說(shuō)明在非兩側(cè)對(duì)稱(chēng)動(dòng)物體內(nèi)出現(xiàn)了原口動(dòng)物類(lèi)TIR（Protostome-like TIR，P-TIR）和原口動(dòng)物類(lèi)LRR（Protostome-like LRR，P-LRR）的結(jié)合，V-TIR區(qū)要比功能性的V-TLR出現(xiàn)的早。對(duì)后口動(dòng)物海膽和文昌魚(yú)中TLRs、LRRs和TIRs序列分析推斷，在V-TLRs形成過(guò)程中脊椎動(dòng)物類(lèi)LRR（Vertebrate-like LRR，V-LRR）和V-TIR之間出現(xiàn)了兩輪結(jié)合。第一次出現(xiàn)在兩側(cè)對(duì)稱(chēng)動(dòng)物和非兩側(cè)對(duì)稱(chēng)動(dòng)物出現(xiàn)分化以后；另一次出現(xiàn)在原始脊椎動(dòng)物進(jìn)化過(guò)程中［49］。同時(shí)，在后口動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)P-TLR，說(shuō)明P-TLR在兩側(cè)對(duì)稱(chēng)動(dòng)物的祖先體內(nèi)是存在的，隨后在脊椎動(dòng)物中消失［30］。

3 TLR基因的多態(tài)性

處于不同進(jìn)化地位的海洋動(dòng)物中無(wú)脊椎動(dòng)物占大多數(shù)，它們主要依靠模式識(shí)別受體來(lái)有效對(duì)抗大量病原體的入侵，因此無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)的模式識(shí)別受體基因表現(xiàn)出高度的多態(tài)性。在貽貝、海膽和文昌魚(yú)中所發(fā)現(xiàn)的TLR基因家族為研究先天性免疫系統(tǒng)多態(tài)性提供了參考依據(jù)。

海膽TLR基因的高度多態(tài)性主要表現(xiàn)在胞外LRRs區(qū)，這表明海膽TLR對(duì)PMAP識(shí)別具有特異性，可以直接和配體結(jié)合而不需要通過(guò)中介物。海膽LRRs區(qū)產(chǎn)生多態(tài)性的機(jī)制包括：?jiǎn)蝹€(gè)氨基酸替換或小片段的插入或缺失，LRR基序內(nèi)部或不同LRR基序之間大片段的插入，以及少數(shù)完整LRR基序的插入［3］。在同屬于原始后口動(dòng)物的美國(guó)文昌魚(yú)中也發(fā)現(xiàn)了具有高度多態(tài)性的TLR基因家族，推測(cè)在后口動(dòng)物祖先中的先天性免疫系統(tǒng)普遍存在多態(tài)性［2］。這種多態(tài)性機(jī)制一方面擴(kuò)大了過(guò)渡物種識(shí)別病原體的范圍，更重要的是有助于適應(yīng)脊椎動(dòng)物復(fù)雜的發(fā)育過(guò)程和形態(tài)結(jié)構(gòu)［50］。將雙殼類(lèi)貽貝中TLR基因和海膽TLR基因多態(tài)性相結(jié)合，推測(cè)它們先天免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性可能和這4個(gè)因素相關(guān)：缺少適應(yīng)性免疫系統(tǒng)；擁有復(fù)雜而龐大的體型；底棲生活并且壽命較長(zhǎng)［20］。從進(jìn)化的角度來(lái)看，TLR基因所表現(xiàn)出的高度多態(tài)性說(shuō)明這些動(dòng)物體內(nèi)的TLR基因正處于一個(gè)動(dòng)態(tài)進(jìn)化階段［3］。

4 小結(jié)

通過(guò)以上分析表明，在最古老的后生動(dòng)物海綿中還沒(méi)有出現(xiàn)完整的TLR，功能性TLR最早是在刺胞動(dòng)物體內(nèi)鑒定得到。隨后在原始后口動(dòng)物海膽和文昌魚(yú)中發(fā)現(xiàn)了大量的TLR家族基因，據(jù)其所表現(xiàn)出的高度多態(tài)性推測(cè)，脊椎動(dòng)物TLR起源于這種復(fù)雜的TLR系統(tǒng)。海洋動(dòng)物TLR基因的多態(tài)性與其生存環(huán)境有密切聯(lián)系，但是環(huán)境因子是如何影響TLR結(jié)構(gòu)仍需要進(jìn)一步的研究證明。目前對(duì)于TLR的研究主要停留在基因組水平上，對(duì)于該受體的功能和配體特異性識(shí)別機(jī)制的研究還不夠深入。因此，加強(qiáng)對(duì)TLR特異性配體的鑒定可為人們揭示TLR基因多態(tài)性機(jī)制和確定TLR進(jìn)化選擇壓力提供依據(jù)。同時(shí)，對(duì)海洋動(dòng)物TLR功能的研究為研制新型基因疫苗、免疫調(diào)節(jié)劑和有效預(yù)防經(jīng)濟(jì)物種病害奠定理論基礎(chǔ)。

［1］ Kawai T, Akira S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity：update on Toll-like receptors［J］. Nat Immunol, 2010, 11（5）：373-384.

［2］ Huang SF, Yuan SC, Guo L, et al. Genomic analysis of the immune gene repertoire of amphioxus reveals extraordinary innate complexity and diversity［J］. Genome Res, 2008, 18（7）：1112-1126.

［3］ Hibino T, Loza-Coll M, Messier C, et al. The immune gene repertoire encoded in the purple sea urchin genome［J］. Dev Bio, 2006, 300（1）：349-365.

［4］ O’Neill LAJ, Bowie AG. The family of five：TIR-domain-containing adaptors in Toll-like receptor signaling［J］. Nat Rev Immunol, 2007, 7（5）：353-364.

［5］ Lin Q, Li MC, Fang D, et al. The essential roles of Toll-like receptor signaling pathways in sterile inflammatory diseases［J］. Int Immunopharmacol, 2011, 11（10）：1422-1432.

［6］ Keogh B, Parker AE. Toll-like receptors as targets for immune disorders［J］. Trends Pharmacol Sci, 2011, 32（7）：435-442.

［7］ Nusslein-Volhard C, Lohs-Schardin M, Sander K, et al. A dorsoventral shift of embryonic primordia in a new maternal-effect mutant of Drosophila［J］. Nature, 1980, 283（5746）：474-476.

［8］ Medzhitov R, Janeway Jr CA.Innate immunity：impact on the adaptive immune response［J］. Curr Opin Immunol, 1997, 9（1）：4-9.

［9］ Coscia MR, Giacomelli S, Oreste U. Toll-like receptors：an overview from invertebrates to vertebrates［J］. ISJ, 2011, 8：210-226.

［10］ Wilson HV. On some phenomena of coalescence and regeneration in sponges［J］. J Exp Zool, 1907, 5（2）：245-258.

［11］ Wiens M, Korzhev M, Perovic-Ottstadt S, et al. Toll-like receptors are part of the innate immune defense system of sponges（demospongiae：Porifera）［J］. Mol Biol Evol, 2007, 24（3）：792-804.

［12］ Srivastava M, Simakov O, Chapman J, et al. The Amphimedon queenslandica genome and the evolution of animal complexity［J］. Nature, 2010, 466（7307）：720-726.

［13］ Gauthier ME, Du PL, Degnan BM. The genome of the sponge Amphimedon queenslandica provides new perspectives into the origin of Toll-like and interleukin 1 receptor pathways［J］. Evol Dev, 2010, 12（5）：519-533.

［14］ Miller DJ, Hemmrich G, Ball EE, et al. The innate immune repertoire in Cnidaria - ancestral complexity and stochastic gene loss［J］. Genome Biol, 2007, 8（4）：R59.

［15］ Bosch TCG, Augustin R, Anton-Erxleben F, et al. Uncovering evolutionary history of innate immunity：the simple metazoan Hydra uses epithelial cells for host defence［J］. Dev Comp Immunol, 2009, 33（4）：559-569.

［16］ Shinzato C, Shoguchi E, Kawashima T, et al. Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change［J］. Nature, 2011, 476（7360）：320-323.

［17］ De Lorgeril J, Zenagui R, Rosa RD, et al. Whole transcriptome profiling of successful immune response to vibrio infections in the oyster Crassostrea gigas by digital gene expression analysis［J］. PLoS ONE, 2011, 6（8）：e23142. doi：10.1371/journal.pone.0023142.

［18］ Hou R, Bao ZM, Wang S, et al. Transcriptome sequencing and de novo analysis for Yesso scallop（Patinopecten yessoensis）using 454 GS FLX［J］. PLoS One, 2011, 6（6）：e21560. doi：10.1371/journal.pone.0021560.

［19］ Venier P, Varotto L, Rosani U, et al. Insights into the innate immunity of the Mediterranean mussel Mytilus galloprovincialis［J］. BMC Genomics, 2011, 12：69.

［20］ Philipp EER, Kraemer L, Melzner F, et al. Massively parallel RNA sequencing identifies a complex immune gene repertoire in the lophotrochozoan Mytilus edulis［J］. PLoS One, 2012, 7（3）：e33091. doi：10.1371/journal.pone.0033091.

［21］ Wang M, Yanga J, Zhoua Z, et al. A primitive Toll-like receptor signaling pathway in mollusk Zhikong scallop Chlamys farreri［J］. Dev Comp Immunol, 2011a, 35（4）：511-520.

［22］ Zhang LL, Li L, Zhang GF. A Crassostrea gigas Toll-like receptor and comparative analysis of TLR pathway in invertebrates［J］. Fish Shellfish Immunol, 2011, 30（2）：653-660.

［23］ Inamori K, Ariki S, Kawabata S. A Toll-like receptor in horseshoe crabs［J］. Immunol Rev, 2004, 198：106-115.

［24］ Belinda LW, Wei WX, Hanh BT, et al. SARM：a novel Toll-like receptor is functionally conserved from arthropod to human［J］. Mol Immunol, 2008, 45（6）：1732-1742.

［25］ Wang PH, Liang JP, Gu ZH, et al. Molecular cloning, characterization and expression analysis of two novel Tolls（LvToll2 and Lv-Toll3）and three putative Sp?tzle-like Toll ligands（LvSpz1-3）from Litopenaeus vannamei［J］. Dev Comp Immunol, 2012, 36（2）：359-371.

［26］ Arts JA, Cornelissen FH, Cijsouw T, et al. Molecular cloning and expression of a Toll receptor in the giant tiger shrimp, Penaeus monodon［J］. Fish Shellfish Immunol, 2007, 23（3）：504-513.

［27］ Yang CJ, Zhang JQ, Li FH, et al. A Toll receptor from Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis is responsive to Vibrio anguillarum infection［J］. Fish Shellfish Immunol, 2008, 24（5）：564-574.

［28］ Mekata T, Kono T, Yoshida T, et al. Identification of cDNA encoding Toll receptor, MjToll gene from kuruma shrimp, Marsupenaeus japonicus［J］. Fish Shellfish Immunol, 2008, 24（1）：122-133.

［29］ Assavalapsakul W, Panyim S. Molecular cloning and tissue distribution of the Toll receptor in the black tiger shrimp, Penaeus monodon［J］. Genet Mol Res, 2012, 11（1）：484-493.

［30］ Rast JP, Smith LC, Loza-Coll M, et al. Genomic insights into the immune system of the sea urchin［J］. Science, 2006, 314（5801）：952-956.

［31］ 楊?lèi)?ài)馥, 周遵春, 孫大鵬, 等.仿剌參鐵蛋白ferritin基因的序列分析及表達(dá)［J］. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2010, 6（34）：710-717.

［32］ Yang AF, Zhou ZC, He CB, et al. Analysis of expressed sequence tags from body wall, intestine and respiratory tree of sea cucumber（Apostichopus japonicus）［J］. Aquaculture, 2009, 296：193-199.

［33］ Yang AF, Zhou ZC, Dong Y, et al. Expression of immune-related genes in embryos and larvae of sea cucumber Apostichopus japonicus［J］. Fish Shellfish Immunol, 2010, 29：839-845.

［34］ Zhou ZC, Sun DP, Yang AF, et al. Molecular characterization and expression analysis of a complement component 3 in the sea cucumber（Apostichopus japonicus）［J］. Fish Shellfish Immunol, 2011； 31：540-547.

［35］ Sun LN, Chen MY, Yang HS, et al. Large scale gene expression profiling during intestine and body wall regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus［J］. Comp Biochem Physiol, 2011, 6（2）：195-205.

［36］ Du HX, Bao ZM, Hou R, et al. Transcriptome sequencing and characterization for the sea cucumber Apostichopus japonicus（Selenka, 1867）［J］. PLoS One, 2012, 7（3）：e33311. doi：10.1371/journal.pone.0033311.

［37］ Delsuc F, Brinkmann H, Chourrout D, et al. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates［J］. Nature, 2006, 439（7079）：965-968.

［38］ Yuan SC, Huang SF, Zhang W, et al. An amphioxus TLR with dynamic embryonic expression pattern responses to pathogens and activates NF-κB pathway via MyD88［J］. Mol Immunol, 2009, 46（11-12）：2348-2356.

［39］ Yuan SC, Wu K, Yang MY, et al. Amphioxus SARM involved in neural development may function as a suppressor of TLR signaling［J］. J Immunol, 2010, 184（12）：6874-6881.

［40］ Azumi K, Santis R, Tomaso A, et al. Genomic analysis of immunity in a Urochordate and the emergence of the vertebrate immune system："waiting for Godot"［J］. Immunogenetics, 2003, 55（8）：570-581.

［41］ Sasaki N, Ogasawara M, Sekiguchi T, et al. Toll-like receptors of the ascidian Ciona intestinalis. prototypes with hybrid functionalities of vertebrate toll-like receptors［J］. Biol Chem, 2009, 284（40）：27336-27343.

［42］ Ishii A, Matsuo A, Sawa H, et al. Lamprey TLRs with properties distinct from those of the variable lymphocyte receptors［J］. J Immunol, 2007, 178（1）：397-406.

［43］ Kasamatsu J, Oshiumi H, Matsumoto M, et al. Phylogenetic and expression analysis of lamprey toll-like receptors［J］. Dev Comp Immunol, 2010, 34（8）：855-865.

［44］ Cateni C, Paulesu L, Bigliardi E, Hamlett WC. The interleukin I（IL-1）system in the uteroplacental complex of a cartilaginous fish, the smoothhound shark, Mustelus canis［J］. Reprod Biol Endncrinol, 2003, 1：25.

［45］ Wu BJ, Xin B, Jin M, et al. Comparative and phylogenetic analyses of three TIR domain-containing adaptors in metazoans：implications for evolution of TLR signaling pathways［J］. Dev Comp Immunol, 2011, 35（7）：764-773.

［46］ Jault C, Pichon L, Chluba J. Toll-like receptor gene family and TIRdomain adapters in Danio rerio［J］. Mol Immunol, 2004, 40（11）：759-771.

［47］ Oshiumi H, Tsujita T, Shida K, et al. Prediction of the prototype of the human Toll-like receptor gene family from the pufferfish, Fugu rubripes, genome［J］. Immunogenetics, 2003, 54（11）：791-800.

［48］ Yniv P. Toll-like receptors in bony fish：From genomics to function［J］. Dev Comp Immunol, 2011, 35（12）：1263-1272.

［49］ Wu BJ, Huan TX, Gong J, et al. Domain combination of the vertebrate-like TLR gene family：implications for their origin and evolution［J］. J Genet, 2011, 90（3）：401-408.

［50］ Pancer Z, Cooper MD. The evolution of adaptive immunity［J］. Annu Rev Immunol, 2006, 24：497-518.