吳明生 云曉敏 宋歌 牛茜 彭瑞迪

（北京市種子管理站，北京 100088）

據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織（ISAAA）發(fā)布的最新資料顯示［1］，2011年全球商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物面積持續(xù)增加，達(dá)到1.6億hm2，實(shí)現(xiàn)連續(xù)15年（1996-2011年）的增長。其中轉(zhuǎn)基因玉米種植面積達(dá)到5 100萬hm2，占到總面積的32%。而與此同時(shí)，我國也把轉(zhuǎn)基因作物研發(fā)作為一項(xiàng)國家戰(zhàn)略加以推進(jìn)，新育成轉(zhuǎn)基因作物品種越來越多，轉(zhuǎn)基因玉米、水稻等主糧作物的商業(yè)化也將被提上日程。

然而科學(xué)界對于轉(zhuǎn)基因植物的安全性備存爭議，使其存在一定的不確定性。普遍觀點(diǎn)認(rèn)為轉(zhuǎn)基因食品安全以及生態(tài)安全性還有待長期、持續(xù)的跟蹤研究。因此，我國目前一方面在加大轉(zhuǎn)基因研發(fā)力度，同時(shí)也在強(qiáng)化對轉(zhuǎn)基因的監(jiān)管，嚴(yán)控農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因污染、保障我國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。而快速、高效、準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)研究及應(yīng)用是加大農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因監(jiān)管力度，提高科學(xué)管理水平的重要手段之一。

DNA快速提取和高效的DNA擴(kuò)增技術(shù)是影響轉(zhuǎn)基因種子快速檢測的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究將熱堿法［2］用于玉米種子粉末樣品的DNA提取，實(shí)現(xiàn)了DNA的快速提取。同時(shí)根據(jù)中國轉(zhuǎn)基因作物檢測與監(jiān)測網(wǎng)和轉(zhuǎn)基因作物數(shù)據(jù)庫（GM Crop Database）提供的信息，對目前商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因玉米品種的分子特征進(jìn)行了分析，統(tǒng)計(jì)了常用的外源基因在這些品種的分布情況（表1）。選擇覆蓋面廣，使用頻率高的3個(gè)外源基因，即CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子和Bar基因作為檢測的靶標(biāo)基因形成組合，通過體系優(yōu)化，形成復(fù)合熒光PCR體系，建立了高效的轉(zhuǎn)基因玉米篩查系統(tǒng)。該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用于轉(zhuǎn)基因玉米成分的大規(guī)模篩查檢測，而且應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR方法可大大提高檢測效率，降低檢測過程中樣品交叉污染和環(huán)境的污染。

表1 商業(yè)化轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化體外源基因應(yīng)用頻數(shù)分析

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品 轉(zhuǎn)基因玉米陽性參照樣品BT176和BT11由中國農(nóng)業(yè)科技發(fā)展中心提供；陰性玉米樣品農(nóng)大108和鄭單958由本實(shí)驗(yàn)室收集，所有樣品經(jīng)粉碎后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 生化試劑 定量反應(yīng)用配套試劑盒TaqMan Universal PCR Master Mix 購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（Applied Biosystems，ABI）。植物新型基因組DNA提取試劑盒、Taq酶、dNTPs、DNA Marker購自北京天根生化科技有限公司，實(shí)時(shí)熒光PCR所用的探針和引物序列見表2，分別采用HEX，F(xiàn)AM，Cy3三種不同熒光標(biāo)記對3個(gè)基因的進(jìn)行標(biāo)記，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。其余試劑由北京化學(xué)試劑公司提供。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與質(zhì)量檢測

1.2.1.1 快速提取法 稱取50 mg玉米粉末樣品加入1.5 mL Eppendorf 離心管中，加入200 μL NaOH溶液（0.1 mol/L），渦旋震蕩30 s，將離心管放在沸水浴中加熱5 min后加入200 mL Tris-HCl溶液（10 mmol/L、pH2.0），渦旋震蕩10 s，上清液即可作為DNA模板用于擴(kuò)增。

1.2.1.2 試劑盒法 參照試劑盒使用說明書。

1.2.1.3 質(zhì)量檢測 采用1.0%瓊脂糖凝膠對兩種方法提取的DNA進(jìn)行電泳檢測。

表2 引物和探針序列信息

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光PCR 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增采用ABI公司提供的試劑盒，反應(yīng)在20 μL的體系中進(jìn)行，其中2×TaqMan Universal PCR Master mix 10 μL，DNA模板1 μL，3個(gè)基因的正反向引物各0.25 μL（10-20 μmol/L），探 針0.5 μL（5-10 μmol/L）。擴(kuò) 增 在ABI7300型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序采用兩步法：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性20 s，60℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 DNA提取質(zhì)量分析

瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果（圖1）顯示，熱堿法提取的DNA與試劑盒法提取的DNA相比，DNA提取的量較少，沒有明顯的亮帶，彌散現(xiàn)象較為嚴(yán)重，這主要是因?yàn)镈NA在熱堿條件下存在降解。但是以兩種方法提取的DNA為模板，通過實(shí)時(shí)熒光PCR方法對玉米內(nèi)源基因zSSIIb進(jìn)行檢測，結(jié)果（圖2）顯示，兩種DNA模板擴(kuò)增效率差異不大，CT值相差約2個(gè)循環(huán)，這主要可能因?yàn)闊晒釶CR方法擴(kuò)增的DNA片段?。?00 bp左右），而且方法的靈敏性好，對DNA模板用量的要求不高。

2.2 復(fù)合熒光PCR體系的建立

為降低不同引物之間的競爭以及熒光背景干擾，將3個(gè)被檢基因的引物和探針濃度設(shè)置不同梯度組合，通過組合之間對比優(yōu)化分析，最終確立3個(gè)被檢基因的引物及探針合適濃度。其中CaMV35S啟動(dòng)子的引物和探針終濃度都為200 nmol/L；NOS終止子和BAR基因的引物終濃度都為250 nmol/L，探針終濃度都為300 nmol/L。優(yōu)化好的體系可對含量為1%轉(zhuǎn)基因陽性參照（BT11和BT176混合樣）的3個(gè)基因進(jìn)行有效擴(kuò)增，CT值都位于30-34之間（圖3）。

2.3 特異性和靈敏度檢測

為檢測復(fù)合熒光PCR的特異性和靈敏度，利用熱堿法提取陽性參照樣品的DNA，并通過梯度稀釋獲得的轉(zhuǎn)基因含量0%、0.01%、0.05%、0.1%和0.5%的DNA模板，用復(fù)合熒光PCR法進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，該方法特異性好，陰性樣品均沒有擴(kuò)增曲線，陽性樣品含有的外源基因都獲得擴(kuò)增，如BT11的CaMV35S啟動(dòng)子和NOS終止子，BT176的CaMV35S啟動(dòng)子和Bar基因。靈敏度分析結(jié)果（表3）顯示，含量≥0.1%樣品的3個(gè)目的基因都得到有效擴(kuò)增（CT值<38），且不同重復(fù)間曲線重合性好，含量小于0.1%樣品擴(kuò)增曲線出現(xiàn)不穩(wěn)定，不同重復(fù)間曲線重合性差。

2.4 樣品的實(shí)際檢測

利用建立的快速方法，對2011年在北京區(qū)域試驗(yàn)和預(yù)備試驗(yàn)的235份玉米品種進(jìn)行了復(fù)測，檢測結(jié)果（未顯示）與先前常規(guī)方法（試劑盒提取DNA，普通PCR檢測）檢測結(jié)果完全一致，而且弱陽性結(jié)果情況發(fā)生概率?。?%），復(fù)檢的樣品少，省事省力，說明該方法具有很強(qiáng)的實(shí)用性，適合大批量樣品的快速檢測。

3 討論

隨著我國以及全球轉(zhuǎn)基因研究的不斷深入，批準(zhǔn)進(jìn)行商業(yè)化種植或作為加工原料進(jìn)口的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品將持續(xù)增加。為確保轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品監(jiān)管到位，保障農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全，加大轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品抽檢力度勢在必行，涉及轉(zhuǎn)基因檢測的樣品量將逐年遞增，因此對轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)提出更高的要求，急需建立快速高效的檢測方法。

提高轉(zhuǎn)基因檢測的效率，首先需要從試驗(yàn)方法上進(jìn)行改進(jìn)。同其它分子檢測一樣，DNA成功提取是進(jìn)行檢測的關(guān)鍵，而DNA提取因方法不同，繁瑣程度差異較大［7，8］，從而影響整個(gè)檢測的效率，因此根據(jù)檢測的需求選擇合適的DNA提取方法顯得非常重要。本研究在利用熱堿法快速提取玉米種子胚DNA并成功進(jìn)行SSR-PCR檢測的研究基礎(chǔ)上［2］，建立了玉米種子粉末DNA快速提取法，雖然該方法提取的DNA質(zhì)量不高，但是針對熒光PCR靈敏度高、擴(kuò)增特異性強(qiáng)以及擴(kuò)增片段小的特點(diǎn)，完全可以滿足后續(xù)檢測的質(zhì)量要求。另外，該方法成本低廉，相對于試劑盒方法，DNA提取費(fèi)用可以忽略不計(jì)。

表3 實(shí)時(shí)熒光復(fù)合PCR特異性與靈敏度檢測

其次要從策略上進(jìn)行改進(jìn)，針對目前繁多的外源基因和轉(zhuǎn)化體，對于大批量樣品的檢測，不可能對其進(jìn)行所有外源基因和轉(zhuǎn)化體的鑒定，只有系統(tǒng)分析轉(zhuǎn)化體的分子特征，篩選使用頻率高的一些外源基因作為靶標(biāo)基因進(jìn)行篩查，對于篩查結(jié)果為陽性的樣品再進(jìn)行轉(zhuǎn)化體鑒定將大大提高檢測的效率。本研究通過分析目前商業(yè)化轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化體的分子特征，確定CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子和Bar 3個(gè)基因?yàn)楹Y查基因，能覆蓋目前所有商業(yè)化的玉米轉(zhuǎn)化體，并且通過體系優(yōu)化，建立同時(shí)檢測3個(gè)基因的復(fù)合熒光PCR方法，僅通過一次PCR擴(kuò)增，只要有一個(gè)基因檢測結(jié)果為陽性，就可以確定該樣品含轉(zhuǎn)基因成分，進(jìn)而采用二分法進(jìn)行品系鑒定，方便快捷，適合大量樣品快速檢測。

4 結(jié)論

將DNA熱堿提取法和復(fù)合熒光PCR技術(shù)相結(jié)合，建立起玉米種子轉(zhuǎn)基因成分快速篩查方法，實(shí)現(xiàn)了DNA快速提取和PCR高效擴(kuò)增有效結(jié)合，不僅能保證檢測準(zhǔn)確性和靈敏性，而且還大大降低假陽性發(fā)生，適合大批量玉米種子樣品的快速篩查檢測，為農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因安全監(jiān)管提供重要的技術(shù)支撐。

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