趙新 王永 蘭青闊 陳銳 李歐靜 余景會(huì) 朱珠 郭永澤

（天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，天津 300381）

大白菜（Brassica campestris L. ssp. pekinensis）為十字花科蕓薹屬葉用蔬菜，原產(chǎn)于我國(guó)，營(yíng)養(yǎng)豐富，易于儲(chǔ)存，因此廣受歡迎。大白菜品種繁多，不同品種的栽培技術(shù)、食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值也存在差異，因此對(duì)市售種子品種的鑒別非常關(guān)鍵，尤其是在農(nóng)戶播種之前利用最短的時(shí)間鑒別出種子品種的真實(shí)性，有效地降低勞動(dòng)成本和經(jīng)濟(jì)損失尤為重要。傳統(tǒng)的田間形態(tài)學(xué)觀察是種子品種鑒定較為常用的方法，但時(shí)間較長(zhǎng)且易受環(huán)境條件的影響，結(jié)果可能存在偏差，因此需要一種更加高效、準(zhǔn)確并且操作簡(jiǎn)便的分子水平品種鑒定方法［1］。同時(shí)新品種的登記、測(cè)試，以及品種間的遺傳距離聚類分析也需要相關(guān)的分子輔助手段［2］。

近年來(lái)出現(xiàn)了多種分子生物學(xué)標(biāo)記技術(shù)，簡(jiǎn)單重復(fù)序列SSR 標(biāo)記（也稱微衛(wèi)星技術(shù)）是其中的一種，與其他分子標(biāo)記技術(shù)相比具有多態(tài)信息含量高、共顯性遺傳、技術(shù)簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)［3，4］，并且在雜交種品種鑒定中得到了大量應(yīng)用。隨著功能基因組學(xué)的迅速發(fā)展，GenBank中積累了許多重要物種的大量EST序列，這些序列獲取簡(jiǎn)便，沒(méi)有任何費(fèi)用，已經(jīng)成為發(fā)展SSR標(biāo)記的重要來(lái)源，因此基于表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tags，EST）的微衛(wèi)星（simple sequence repeats，SSR）標(biāo)記技術(shù)不僅保留了SSR標(biāo)記技術(shù)的所有優(yōu)點(diǎn)，而且凸顯了其便捷、花費(fèi)低、效率高的優(yōu)勢(shì)；但SSR技術(shù)也存在著相對(duì)的不足，即一次試驗(yàn)得到的位點(diǎn)較少，針對(duì)這一問(wèn)題Tommasini等［5］發(fā)展了多重SSR分析技術(shù)，并有效地鑒定了油菜品種。

本研究以12份大白菜雜交種為試驗(yàn)材料，利用新型分子標(biāo)記復(fù)合EST-SSR進(jìn)行大白菜品種鑒定研究，篩選其多態(tài)性特異譜帶，并以該譜帶作為分子標(biāo)記對(duì)其品種進(jìn)行區(qū)分。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為12份市售大白菜雜交種，由天津科潤(rùn)蔬菜研究所提供，具體信息見(jiàn)表1。

表1 品種名稱及編號(hào)

1.2 方法

1.2.1 EST-SSR引物的開(kāi)發(fā) 利用GenBank上公布的大白菜EST序列，設(shè)計(jì)合成30對(duì)核心引物，命名為BC1-BC30，引物由上海生工合成。

1.2.2 大白菜基因組DNA提取 利用改良CTAB法［6］分別提取12份大白菜雜交種葉片基因組DNA，將獲得的植物組DNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 引物篩選 以大白菜雜交種的基因組DNA為模板，分別對(duì)30對(duì)EST-SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離、染色，在能夠得到有效擴(kuò)增的引物中篩選多態(tài)性高的特異譜帶，同時(shí)結(jié)合單一引物品種鑒定結(jié)果及特異譜帶的相互位置差異，優(yōu)化組合多個(gè)引物對(duì)，篩選復(fù)合EST-SSR標(biāo)記。

1.2.4 PCR擴(kuò)增體系及程序 PCR擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為10 μL，擴(kuò)增反 應(yīng)體系為：2×GoTaq?Master Mixes 5 μL，上下游引物10 μmol/L各0.25 μL（Ⅰ套EST-SSR復(fù)合引物中BC1上游引物、BC1下游引物、BC19上游引物、BC19下游引物、BC26上游引物、BC26下游引物均等量混合各0.25 μL；或Ⅱ套ESTSSR復(fù)合引物中BC1上游引物、BC1下游引物、BC9上游引物、BC9下游引物、BC10上游引物、BC10下游引物、BC16上游引物、BC16下游引物、BC27上游引物、BC27下游引物均等量混合各0.25 μL），供試品種大白菜基因組DNA模板，濃度50 ng/μL，1 μL，雙蒸水補(bǔ)足10 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 1 min，53.5℃ 45 s，72℃ 45 s 35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃保存。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析及聚類圖譜構(gòu)建 根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜，每個(gè)樣品的特異性譜帶按照相互位置差異在相同遷移率位置上進(jìn)行有無(wú)的“1，0”標(biāo)注，根據(jù)標(biāo)注結(jié)果計(jì)算2套引物的多態(tài)率和多態(tài)信息量（PIC），分析2套引物對(duì)12份大白菜品種的鑒定結(jié)果，并應(yīng)用NTSYS聚類分析軟件構(gòu)建12份大白菜品種的聚類圖譜。

2 結(jié)果

2.1 大白菜葉片基因組DNA的提取

利用改良CTAB方法提取大白菜葉片基因組DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果（圖1）顯示，所提取的基因組DNA主帶清晰，整齊一致，無(wú)明顯降解，可用于下一步PCR擴(kuò)增。

圖1 大白菜基因組DNA電泳圖

2.2 引物篩選結(jié)果

利用SSR技術(shù)對(duì)天津科潤(rùn)蔬菜研究所提供的大白菜雜交種進(jìn)行了特異性分子標(biāo)記分析，共利用30對(duì)EST-SSR引物進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，其中21對(duì)得到有效擴(kuò)增，10對(duì)具有較高的多態(tài)率及多態(tài)信息量，根據(jù)這10對(duì)引物擴(kuò)增條帶的相互位置差異，進(jìn)行優(yōu)化組合，確定了2套復(fù)合引物可對(duì)12份大白菜品種進(jìn)行完全的區(qū)分。引物序列見(jiàn)表2，應(yīng)用2套復(fù)合引物對(duì)12份大白菜進(jìn)行品種鑒定的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜如圖2、圖3所示。

表2 引物序列

2.3 復(fù)合標(biāo)記12份大白菜品種的多態(tài)性分析及聚類分析結(jié)果

通過(guò)分析EST-SSR結(jié)果，比較12份大白菜品種間多態(tài)性位點(diǎn)的差異，確定2套復(fù)合引物的多態(tài)率及多態(tài)信息量；在相同遷移率位置上進(jìn)行“1，0”標(biāo)注，構(gòu)建12份大白菜品種的SSR分析譜帶數(shù)據(jù)（表3），通過(guò)數(shù)據(jù)分析復(fù)合引物是否可對(duì)12份大白菜品種進(jìn)行完全的區(qū)分，同時(shí)構(gòu)建12份大白菜品種的聚類圖譜（圖4）。

表3 復(fù)合EST-SSR引物組合鑒定大白菜品種的多態(tài)性分析

3 討論

隨著植物育種和種子產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，植物新品種保護(hù)（Protection of New Varieties of Plant，簡(jiǎn)稱PVP）作為知識(shí)產(chǎn)權(quán)的10種內(nèi)容之一，其重要性越來(lái)越突出。培育和推廣新的優(yōu)良品種是我國(guó)蔬菜育種發(fā)展的重要方向，因此新品種的準(zhǔn)確鑒定不僅是新品種審定和保護(hù)的前提，也為辨別假冒偽劣種子，保護(hù)自身知識(shí)產(chǎn)權(quán)，維護(hù)育種農(nóng)家的切身利益提供保障和科學(xué)依據(jù)。因此，開(kāi)發(fā)高效、準(zhǔn)確的種子品種鑒定方法已成為種子科研單位和企業(yè)共同關(guān)注的課題。

近年來(lái)隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，遺傳標(biāo)記經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、蛋白質(zhì)標(biāo)記已經(jīng)發(fā)展到了DNA水平的標(biāo)記。各種DNA標(biāo)記技術(shù)在雜交種品種鑒定中層出不窮，EST-SSR是近幾年建立的新型分子標(biāo)記技術(shù)，目前已應(yīng)用于水稻、小麥、高羊茅、黑楊等［7-10］植物的分子連鎖圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性分析，證明了EST-SSR標(biāo)記進(jìn)行品種鑒定的可行性，該技術(shù)具有穩(wěn)定性高、共顯性、重復(fù)性好等特點(diǎn)，而且開(kāi)發(fā)成本相對(duì)低廉。

為了進(jìn)一步提高EST-SSR的多態(tài)性，更加高效地進(jìn)行相關(guān)物種的品種鑒定，本研究以大白菜為試驗(yàn)材料，摸索了多重EST-SSR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，構(gòu)建了2套復(fù)合EST-SSR引物組合可完全對(duì)12份大白菜品種進(jìn)行區(qū)分。復(fù)合引物標(biāo)記的構(gòu)建需要根據(jù)單一引物的相互位置差異進(jìn)行優(yōu)化組合，使單一引物的擴(kuò)增片段處在不同片段大小的區(qū)域，避免復(fù)合標(biāo)記的重疊性。復(fù)合EST-SSR標(biāo)記對(duì)大白菜雜交品種具有很好的區(qū)分效果，可通過(guò)一次反應(yīng)檢測(cè)到高水平的多態(tài)性，同時(shí)所建立的試驗(yàn)組合、方法和思路，具有一定的推廣性，不僅僅局限于12份大白菜品種的鑒定，通過(guò)對(duì)30對(duì)核心引物的組合優(yōu)化，可以對(duì)更多的大白菜品種進(jìn)行標(biāo)記和鑒定的研究，進(jìn)而為有效地解決大白菜雜交種的鑒別問(wèn)題提供技術(shù)參考。本研究的檢測(cè)方法在不計(jì)算DNA提取過(guò)程耗時(shí)的情況下，PCR耗時(shí)2 h，EST-SSR分析60-90 min，所以本發(fā)明的檢測(cè)方法在4 h之內(nèi)即可完成對(duì)大白菜品種的鑒定工作，具有高效、低成本、操作方便等優(yōu)勢(shì)。

4 結(jié)論

本研究?jī)H以12份市售大白菜品種為例，通過(guò)EST-SSR標(biāo)記的特異譜帶進(jìn)行聚類分析，表明12份大白菜品種兩兩間的相似系數(shù)在0.53-0.96之間，平均值為0.75，以遺傳相似系數(shù)0.96為標(biāo)準(zhǔn)，復(fù)合EST-SSR引物組合擴(kuò)增的特異性譜帶數(shù)據(jù)，能將市售大白菜的12份品種完全區(qū)分開(kāi)。這些研究方法和結(jié)果對(duì)建立大白菜新種質(zhì)、新品種保護(hù)以及種苗質(zhì)量仲裁檢驗(yàn)等都具有重要意義。

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