孫變娜 沈和定 吳洪喜 姚理想 程知慶 王冬鳳

(1.上海海洋大學(xué)省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 201306;2.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所 浙江溫州 325005;3.浙江省近岸水域生物資源開(kāi)發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)試驗(yàn)室 浙江溫州 325005)

紫色疣石磺Peronia verruculata隸屬軟體動(dòng)物門(Mollusca),腹足綱(Gastropoda),肺螺亞綱(有肺類Pulmonata),縮眼目(Systellommatophora),石磺科(Onchidiidae);其身體柔軟無(wú)貝殼,軀體背后部有樹(shù)枝狀鰓[1]。紫色疣石磺多見(jiàn)于我國(guó)福建、廣東、海南、香港等地沿海潮間帶的中下部灘涂,越南、泰國(guó)等東南亞國(guó)家沿海也有分布,資源豐富。石磺產(chǎn)品已在江蘇鹽城(俗稱海癩子)、浙江溫州(俗稱涂龜)、福建寧德(俗稱土鮑)等地形成廣泛的市場(chǎng),民間流傳石磺有治哮喘、治療風(fēng)濕病、滋補(bǔ)、助消化、消除疲勞、明目等功效。冰糖燉石磺據(jù)說(shuō)對(duì)治療哮喘有特效,并常被作為產(chǎn)后孕婦良好的滋補(bǔ)品;沿海居民食用石磺的歷史悠久[2]。在中國(guó)海洋藥物辭典中有如下記載:石磺別名土海參,四季捕撈,捕后洗凈,除去內(nèi)臟,取肉鮮用;肉入藥;有滋補(bǔ)強(qiáng)壯之功效;主治肝硬化、久病體虛等癥狀[3]。近幾年國(guó)內(nèi)石磺產(chǎn)品供不應(yīng)求,已從越南等國(guó)大量進(jìn)口。國(guó)內(nèi)外對(duì)石磺的研究主要集中在系統(tǒng)分類[1,4,5-7]、生物學(xué)特性[8-10]、受精機(jī)制[11]、繁殖[12-14]、胚胎發(fā)育[15-16]、神經(jīng)系統(tǒng)[17]、線粒體基因組全序列分析[18]、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[19-20]等,目前,紫色疣石磺中膽甾醇的測(cè)定尚未見(jiàn)報(bào)道。膽甾醇的測(cè)定方法主要有吸光光度法、氣相色譜法與高效液相色譜法等。隨著色譜技術(shù)的發(fā)展,高效液相色譜法因其樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單,方法準(zhǔn)確度、精確度及靈敏度較高,在測(cè)定生物組織中膽甾醇含量的應(yīng)用中日益廣泛[21-23]。本實(shí)驗(yàn)擬建立高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定紫色疣石磺中的膽甾醇含量,能為膽甾醇分析方法的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

動(dòng)物材料于2012年11月采集自廣東湛江,經(jīng)上海海洋大學(xué)沈和定教授鑒定為紫色疣石磺(Peronia verruculata),憑證標(biāo)本(No.12DZ-1) 超低溫(-80℃)保存在上海海洋大學(xué)海洋貝類實(shí)驗(yàn)室。取紫色疣石磺解剖并去除內(nèi)臟,用液氮研磨成粉末。膽甾醇標(biāo)準(zhǔn)品:Sigma公司(C8667);甲醇為色譜純(Fisher公司),其他藥品、試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

日立L-2130高效液相色譜儀,日立L-2130型泵系統(tǒng),日立L-2450紫外檢測(cè)器;電熱恒溫水浴;KQ-50B舒美超聲波清洗器;AUY120型電子分析天平。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取膽甾醇對(duì)照品約51mg,置于50mL量瓶中,加適量甲醇超聲溶解,用甲醇定容至刻度,搖勻,即得1.02mg/mL的對(duì)照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取紫色疣石磺粗粉10.0g,置于250mL具塞錐形瓶中,加三氯甲烷:甲醇(2:1)混合液125mL,超聲提取3次,每次20min,用快速濾紙過(guò)濾,濾紙及殘?jiān)没旌弦合礈鞌?shù)次,收集濾液和洗液,置于250mL具塞圓底燒瓶中,加入無(wú)水乙醇25mL,500g/L氫氧化鉀溶液6mL,在60～65℃水浴皂化45min,皂化時(shí)不斷振搖;皂化完畢后,稍冷后加入25mL 50g/L氯化鈉溶液,混勻后加入37.5mL乙醚萃取3次,將乙醚溶液置于250mL分液漏斗中,加少量水多次洗滌提取液(至洗滌液為中性),提取液用無(wú)水硫酸鈉脫水,水浴揮干溶劑,用甲醇定容至100mL,混勻,即得供試品溶液。

1.2.3 色譜條件

色譜柱:COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ,(4.6mm×250mm,5μm);流動(dòng)相:甲醇;流速1.0mL/min;進(jìn)樣量:20μL;柱溫:35℃。紫外檢測(cè)器波長(zhǎng):204nm。

1.3 定量測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線:精密吸取膽甾醇對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL,分別置于2mL容量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻。采用外標(biāo)定量。樣品中的膽甾醇含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行計(jì)算。

1.4 回收率測(cè)定

在同一樣品中加入一定量的膽甾醇標(biāo)準(zhǔn)品,制備供試品溶液,進(jìn)樣測(cè)定,以考察方法的準(zhǔn)確度。

2 結(jié)果與分析

2.1 膽甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

根據(jù)不同質(zhì)量濃度膽甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的出峰面積,以膽甾醇質(zhì)量濃度X(mg/mL)為橫坐標(biāo),峰面積Y為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(見(jiàn)圖1)。膽甾醇標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖如圖2所示。

由圖1可知,膽甾醇在0.102～0.510mg/mL范圍內(nèi)峰面積與濃度的線性回歸方程為,Y=44186105X-331118相關(guān)系數(shù)R2為0.9998,表明膽甾醇在此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。由圖2可知,膽甾醇的保留時(shí)間為13min,出峰較快,為快速檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

2.2 回收率測(cè)定

取已知含量的紫色疣石磺粗粉約5g,共5份,精密稱定,分別加入不同濃度膽甾醇對(duì)照品,“1.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液,分別測(cè)定,利用差減法求出膽甾醇的回收率(見(jiàn)表1)。結(jié)果表明,此方法的平均回收率為98.53%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.72%。

2.3 精密度測(cè)定

同一樣品重復(fù)進(jìn)樣6次,所測(cè)峰面積平均值為43517511.33±156546.4,RSD為0.36%。結(jié)果表明精密度良好。

2.4 樣品的測(cè)定

取3批樣品,按“1.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液,按上述色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定峰面積并計(jì)算含量。3批樣品中膽甾醇含量見(jiàn)表2。由結(jié)果知,高效液相色譜法測(cè)得該紫色疣石磺樣品中膽甾醇的平均質(zhì)量濃度為50.37μg/mL,換算到原料中膽甾醇的平均質(zhì)量濃度為503.7mg/kg。

3 結(jié)語(yǔ)

膽甾醇是維持人體正常新陳代謝不可缺少的原料,是抗老防衰、延年益壽的重要物質(zhì)之一。它不僅是構(gòu)成細(xì)胞膜的重要組成成分,而且是合成膽汁酸,維生素D以及甾體激素的原料。

本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜法快速測(cè)定紫色疣石磺中膽甾醇含量的檢測(cè)方法。通過(guò)加標(biāo)回收和精密度實(shí)驗(yàn),表明利用高效液相色譜測(cè)定紫色疣石磺中膽甾醇含量在0.102～0.510mg/mL范圍內(nèi)與峰面積值的線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)R2為0.9998,回收率范圍在96.08%～100.98%,RSD=1.72%,膽甾醇出峰時(shí)間為13min,紫色疣石磺樣品的膽甾醇質(zhì)量濃度為503.7mg/kg。曾報(bào)道過(guò)使用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器[23]、電化學(xué)檢測(cè)器[24]的高效液相色譜法測(cè)定膽甾醇含量的研究,本實(shí)驗(yàn)使用紫外檢測(cè)器的高效液相色譜法,達(dá)到了良好的分離效果。該方法簡(jiǎn)便、快速,準(zhǔn)確,靈敏度和精密度高,分析時(shí)間短,能快速檢測(cè)紫色疣石磺中膽甾醇,可為石磺資源綜合利用與開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

表1 回收率測(cè)定結(jié)果

表2 紫色疣石磺中膽甾醇含量

圖1 膽甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 膽甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

紫色疣石磺 Peronia verruculata

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