陳菲云 張大偉 劉森

(1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院/分子生物學(xué)研究所 湖北宜昌 443002;2.中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 天津 300308)

對三維結(jié)構(gòu)及其功能之間的相互關(guān)系并不明確的酶進(jìn)行改造,定向進(jìn)化方法是很好的選擇。定向進(jìn)化就是利用自然選擇的方法使工程蛋白能夠獲得天然蛋白不具備的特定性質(zhì)的一種方法[1]。它不需要對蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系有深刻的了解,它僅通過隨機(jī)突變或基因重組技術(shù)建立起突變體文庫,然后連接到表達(dá)載體導(dǎo)入宿主內(nèi)進(jìn)行蛋白表達(dá),具有改進(jìn)性狀的突變體被篩選出來再進(jìn)行下一輪突變直至得到符合要求的突變體。文獻(xiàn)資料已有大量關(guān)于利用定向進(jìn)化成功改變了分子的特異性和催化性能的例子[2]。

定向進(jìn)化的步驟包括DNA突變庫的體外構(gòu)建和DNA突變庫向宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。其中DNA突變庫的體外構(gòu)建的常見方法已有不少文章總結(jié)過[3,4],本文選擇的是簡單高效的易錯(cuò)PCR法。DNA突變庫向宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化是至關(guān)重要的一步,因?yàn)閹烊萘康拇笮∈苻D(zhuǎn)化效率的限制,從而影響獲得好的突變體的機(jī)率。然而應(yīng)用廣泛的表達(dá)宿主菌大腸桿菌雖背景清楚,生長繁殖快,易操作[5],是最常用的定向進(jìn)化宿主菌。但其中作為蛋白表達(dá)常用的BL21(DE3)的轉(zhuǎn)化效率僅是DH5α的十分之一,不利于突變體庫的建立。綜上,高效的克隆轉(zhuǎn)化方法是定向進(jìn)化方法所需求的。

做克隆最常用的是酶切連接法,是分子實(shí)驗(yàn)常規(guī)的一種分子操作方法。但是在實(shí)際操作過程中,酶切連接法有一定的局限性,存在操作繁瑣,耗時(shí)長,且轉(zhuǎn)化率低,不適于建庫等需要大容量克隆的實(shí)驗(yàn)。其它的克隆轉(zhuǎn)化的方法也已經(jīng)有很多種[6,7,8,9,10],我們選取了其中簡便高效的PCR法直接獲得多聚質(zhì)粒的方法做突變體庫,與已有的常規(guī)方法比較。

通過比較兩種克隆轉(zhuǎn)化方法,分析兩種方法的應(yīng)用效果。從而選擇高效的克隆轉(zhuǎn)化方法作為突變體庫構(gòu)建方法,為下一步高通量篩選奠定良好的基礎(chǔ),也為其他人做定向進(jìn)化突變體庫提供了很好的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒pET21a-lysozyme是本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建,pET21a載體為本實(shí)驗(yàn)室自存。大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。內(nèi)切酶,T4連接酶及Q5超保真DNA聚合酶均為New England Biolabs公司產(chǎn)品。Agorose是Biowest的Regular agarose G-10。核酸電泳系統(tǒng)是北京六一儀器廠產(chǎn)品。Pcr儀購自東勝國際貿(mào)易有限公司。易錯(cuò)pcr試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司。

1.2 常用的克隆轉(zhuǎn)化方法構(gòu)建突變體庫

1.2.1 基于pcr的隨機(jī)突變

以質(zhì)粒pET21a-lysozyme為模板,用易錯(cuò)pcr法構(gòu)建lysozyme序列的隨機(jī)突變庫,首先根據(jù)溶菌酶序列設(shè)計(jì)兩條引物,引物為表1中的Lysozyme F和Lysozyme R。為了得到突變體庫,易錯(cuò)PCR的反應(yīng)體系中添加了Mn2+離子,而且反應(yīng)所用的四種dNTP不是等比例的,我們用的是即用型易錯(cuò)PCR試劑盒,其各項(xiàng)試劑的比例是經(jīng)過優(yōu)化的。

50uL易錯(cuò)pcr體系如下:5uL 10×易錯(cuò)pcr緩沖液,5uL 10×易錯(cuò)pcr專用dNTP,5uL MnCl2(5mM),1uL模板質(zhì)粒pET21alysozyme(10 ng/uL),各1uL PCR引物F/R(10 uM),1uL TaqDNA聚合酶(5U/uL),ddH2O補(bǔ)至50 uL。

PCR擴(kuò)增條件:94℃ 3min;94℃ 1min,60℃ 1min,72℃ 1 min,30個(gè)循環(huán);72℃ 10min。

易錯(cuò)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物即為lysozyme序列的隨機(jī)突變庫。

1.2.2 突變文庫的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠分離,膠回收純化后,限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI分別對易錯(cuò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pET21a-lysozyme進(jìn)行酶切。酶切后的PCR產(chǎn)物純化,酶切后的載體經(jīng)瓊脂糖凝膠分離,切膠回收線性化載體片段,然后將酶切純化后的PCR產(chǎn)物和酶切膠回收的載體按照物質(zhì)的量3:1以T4連接酶連接體系進(jìn)行連接。

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞或?qū)⑦B接產(chǎn)物純化后,轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。涂布于LB(含100ug/uL的Amp)平板。37℃恒溫培養(yǎng)12h后,察看單菌落數(shù)量。

1.3 PCR產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化方法構(gòu)建突變體庫

(1)此方法的引物設(shè)計(jì)及流程(圖1),首先仍然是以質(zhì)粒pET21alysozyme為模板,用易錯(cuò)pcr法構(gòu)建lysozyme序列的隨機(jī)突變庫,引物為Table 1的P1,P2,去掉了酶切位點(diǎn)兩邊的保護(hù)堿基,以便于Overlap PCR的順利進(jìn)行。

表1 文中所用引物匯總 (Table 1 Oligonucleotides used in this study.)

圖1 新方法構(gòu)建突變體庫實(shí)驗(yàn)流程P1,P2是易錯(cuò)PCR引物;P3,P4是質(zhì)粒線性化引物;lysozyme是我們突變體庫的目的序列,其它是質(zhì)粒上的一些基本元件。Fig 1 The flow scheme of the two-step PCR procedure for the gene mutagenesis and plasmid multimerization.Lysozyme is the purpose sequence of our mutant library,others are the basic components of the plasmid.P1,P2,P3 and P4 denote the positions of the primers for the PCR amplication.

圖2 常規(guī)方法建立突變體庫過程中易錯(cuò)PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖M是marker;1是易錯(cuò)PCR產(chǎn)物Fig.2 Error-prone PCR products of the routine method.M:1Kb DNA marker;1:error-prone PCR products

圖3 兩種克隆轉(zhuǎn)化方法所得克隆數(shù)量比較1是常規(guī)方法做克隆轉(zhuǎn)化所得克隆數(shù)量,2是新方法所得的克隆數(shù)量Fig.3 The number of clones obtained by the two methods in Constructing Mutant Library in E.coli BL21(DE3).1:Result of transformation by routine method 2:Result of transformation by new method.

圖4 多聚PCR法直接轉(zhuǎn)化構(gòu)建突變體庫的凝膠電泳圖M是marker;1是易錯(cuò)PCR產(chǎn)物;2是線性化質(zhì)粒PCR產(chǎn)物;3是overlap PCR 產(chǎn)物多聚化質(zhì)粒;4是多聚質(zhì)粒用NdeI和XhoI酶切后的產(chǎn)物Fig.4 Analysis of a 1%agarose gel for the PCR products of New method.M:marker;1:Error-prone PCR products of new method;2:PCR linearized vector;3:DNAmultimer generated by overlap extension PCR;4:Multimer digested with two restriction enzymes

PCR體系及擴(kuò)增條件同1.2.1。

(2)通過PCR將質(zhì)粒pET21a-lysozyme線性化。通過高保真PCR線性化質(zhì)粒pET21a-lysozyme,引物設(shè)計(jì)時(shí),要使線性化質(zhì)粒包含要突變的溶菌酶的一部分序列,以便于下一步overlapPCR線性化質(zhì)粒與易錯(cuò)PCR序列有重疊區(qū),引物為表1中P3,P4。

50uLPCR反應(yīng)體系如下:10uL 5×buffer,5uL 10×dNTP Mix,1uL模板質(zhì)粒pET21a-lysozyme(10ng/uL),各1uL PCR引物F/R(10uM),0.5uL Q5超保真DNA聚合酶(2000U/uL),ddH2O補(bǔ)至50uL。

PCR擴(kuò)增條件:98℃ 2min;98℃ 15 s,55℃ 30 s,72℃ 3min,30個(gè)循環(huán);72℃ 10min。

(3)通過Overlap PCR得到多聚化的重組質(zhì)粒。線性化后的質(zhì)粒和易錯(cuò)pcr的產(chǎn)物均通過瓊脂糖凝膠電泳分離檢測,然后用凝膠回收試劑盒回收所需條帶,測定濃度。

Overlap PCR的反應(yīng)體系:10uL 5×buffer,5uL 10×dNTP Mix易錯(cuò)pcr產(chǎn)物(體系終濃度2ng/uL),線性化質(zhì)粒(與易錯(cuò)pcr產(chǎn)物等摩爾質(zhì)量),0。5uL Q5超保真DNA聚合酶(2000U/uL),ddH2O補(bǔ)至50uL。

擴(kuò)增條件:98℃ 3 min;98℃ 15 s,55℃ 30s,72℃ 5min,30個(gè)循環(huán);72℃ 10min。

(4)產(chǎn)物鑒定。將Overlap PCR得到的多聚化的重組質(zhì)粒用醇沉法純化后,用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI酶切,以鑒定所得PCR產(chǎn)物是否是含有溶菌酶序列的pET21a質(zhì)粒。

將通過Overlap PCR得到的多聚化的重組質(zhì)粒10uL轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞,涂布于LB(含100ug/uL的Amp)平板。37℃恒溫培養(yǎng)12h后,察看單菌落數(shù)量。（表1）

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)方法構(gòu)建突變體庫

首先構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET21a-lysozyme,重組質(zhì)粒包含一段954bp的溶菌酶基因,以質(zhì)粒pET21a-lysozyme為模板,在溶菌酶基因兩端設(shè)計(jì)引物以易錯(cuò)pcr法得到lysozyme序列的隨機(jī)突變庫。經(jīng)瓊脂糖凝膠分離鑒定:在marker 1000bp靠下的位置得到一條明亮單一的條帶(圖2),由此可見易錯(cuò)PCR產(chǎn)物為所需目的片段。

質(zhì)粒酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠分離,將線性化載體片段切膠回收與PCR酶切后的片段連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。用此種方法做突變庫,無論是用化學(xué)轉(zhuǎn)化法還是轉(zhuǎn)化效率相對較高的電轉(zhuǎn)化法,得到的單菌落數(shù)量均不多,一再提高之前做連接所用的質(zhì)粒線性片段與PCR酶切產(chǎn)物的量也不能解決問題。每個(gè)平板所得的單菌落數(shù)量始終在50以下(圖3中1)。

2.2 多聚PCR產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化法構(gòu)建突變體庫

此方法仍然從質(zhì)粒pET21a-lysozyme出發(fā),經(jīng)瓊脂糖凝膠鑒定仍可見明亮的與目的產(chǎn)物大小相符的條帶(圖4的1)。第二步引物設(shè)計(jì)在溶菌酶基因內(nèi)部,這樣線性化質(zhì)粒與溶菌酶基因兩邊均有100bp重疊序列。于是,線性化質(zhì)粒的全長序列為5620bp,PCR完成后經(jīng)瓊脂糖凝膠鑒定,與目的片段大小相符(圖4的2)。將上兩步PCR所得產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離并切膠回收目的片段后,測定所得的兩個(gè)目的片段濃度,然后按1:1比例做第三步的overlap PCR,此次PCR產(chǎn)物為多聚質(zhì)粒,分子量過大,產(chǎn)物只是聚集在點(diǎn)樣孔內(nèi)(圖4的3)。為了驗(yàn)證所得產(chǎn)物為目的質(zhì)粒,我們將overlap PCR的產(chǎn)物純化后用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后可見明顯的兩條帶,其大小與我們的質(zhì)粒pET21a和插入片段大小相符(圖4的4)。

將所得的Overlap PCR產(chǎn)物直接以化學(xué)轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,涂布在含有氨芐的固體平板上,長出的單菌落庫即為預(yù)期隨機(jī)突變體庫。用此種方法建突變體庫,效率很高,平均每個(gè)平板的單菌落數(shù)量均在200以上(圖3的2)。而且以此種方法做克隆,每管overlap PCR產(chǎn)物可轉(zhuǎn)化至少5個(gè)平板,單次產(chǎn)出高。

3 討論

在以BL21為宿主表達(dá)目的蛋白的過程當(dāng)中,一般是將目的基因首先用不含有T7 RNA聚合酶基因的宿主菌進(jìn)行克隆,比如DH5α。完成克隆后,將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入染色體上帶有l(wèi)ac UV 5調(diào)控的T7 RNA聚合酶基因的表達(dá)宿主菌中,用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。這樣一則是為了避免對宿主細(xì)胞有毒的蛋白產(chǎn)物影響質(zhì)粒的穩(wěn)定性。一則是由于BL21的轉(zhuǎn)化效率低,僅是DH5α克隆型宿主菌的轉(zhuǎn)化效率的十分之一,不利于常規(guī)方法做克隆時(shí)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。但是由于我們要建立基因突變庫,需要一步到位得到大量單克隆,先轉(zhuǎn)化DH5α再提質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21會(huì)降低建庫效率且增大后期篩選難度。而BL21的轉(zhuǎn)化效率又確實(shí)不利于大量突變體庫的獲得,于是我們需要改進(jìn)克隆轉(zhuǎn)化方法。

文獻(xiàn)中介紹的PCR直接獲得多聚體的克隆轉(zhuǎn)化法在BL21中的轉(zhuǎn)化文章中已實(shí)驗(yàn)過[10]。按照文獻(xiàn)中的實(shí)驗(yàn)方法,結(jié)合我們的實(shí)驗(yàn)需求,設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)流程如圖1所示,DNA突變庫的獲得僅需要三步PCR。

與常規(guī)克隆轉(zhuǎn)化方法相比,新方法步驟減少,操作簡單而且省時(shí)高效。常規(guī)方法構(gòu)建突變體庫至少需要兩天時(shí)間,而新方法一天就可以完成。常規(guī)方法不僅步驟較多,耗時(shí)長,而且操作步驟多造成的DNA突變庫損失也大,最后轉(zhuǎn)化效率又很低,所以用常規(guī)方法做突變體庫太過困難,需要大量重復(fù)操作。新方法僅是三步PCR反應(yīng),省去了酶切再連接的繁瑣,不單節(jié)省時(shí)間而且避免了酶切連接過程中的產(chǎn)物損失,一輪實(shí)驗(yàn)就可以得到大量突變子,是一種簡單實(shí)用且高效的突變體庫建立方法。

綜上,本文將常規(guī)克隆轉(zhuǎn)化方法與新方法建立突變體庫進(jìn)行了比較,結(jié)果表明新方法在定向進(jìn)化突變體庫的構(gòu)建上具有較大優(yōu)勢,這種簡單高效實(shí)用的突變體庫構(gòu)建方法值得借鑒。

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