呂芬 劉忠 銀興峰 趙振嶺 陳妙娟 張嘉萱 陳偉 錢垂文 熊盛

（1.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生物醫(yī)藥研究開發(fā)基地，廣州 510632；2.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生命與健康工程研究院，廣州 510632）

核苷二磷酸激酶A（nucleoside diphosphate kinase A，NDPK-A），是Nm23-H1基因編碼的多功能蛋白，可以調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、發(fā)育、遷移、凋亡，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生物學(xué)活動［1］。Nm23-H1最早被鑒定為腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因以來，一直是腫瘤研究的熱點。針對多種腫瘤細胞株，如黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、肝癌等，Nm23-H1的過表達表現(xiàn)出抑制細胞遷移的能力；然而，在惡性白血病、神經(jīng)母細胞瘤、骨肉瘤患者體內(nèi)，Nm23-H1的高表達卻使生存率降低；在鼻咽癌、直腸癌中，Nm23-H1的表達與腫瘤轉(zhuǎn)移并無明顯關(guān)系［2］。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)模式使得Nm23-H1成為決定腫瘤細胞命運的關(guān)鍵分子，而成為備受關(guān)注的藥物作用靶標。關(guān)于Nm23-H1多功能調(diào)節(jié)的分子機制，目前還未被透徹地揭示。眾所周知，腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移的分子基礎(chǔ)是一個立體、整體水平上的蛋白質(zhì)間相互作用的結(jié)果。目前，越來越多的研究聚焦于去發(fā)現(xiàn)在重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，與NDPK-A相互作用的伙伴蛋白。如GTP結(jié)合蛋白［3］、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子［4］、SET復(fù)合物［5］等以及與相關(guān)蛋白結(jié)合參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，如Erk Map激酶途徑［6］、TGF-β信號途徑［7］等，證據(jù)表明，NDPK-A與這些蛋白相互作用、相互影響、共同調(diào)控，涉及腫瘤細胞的發(fā)生、增殖、遷移、凋亡、分化、血管生成、DNA修復(fù)等各個方面的相關(guān)性。為了進一步研究NDPK-A在細胞中扮演的角色，本研究通過基因工程技術(shù)體外構(gòu)建表達載體，誘導(dǎo)可溶性GST-NDPK-A融合蛋白的高效表達，親和純化，利用GST-Pull down技術(shù)在肺腺癌A549細胞中篩選與NDPK-A結(jié)合的蛋白質(zhì)，并經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，LC-MS/MS質(zhì)譜分析進行鑒定，試圖尋找與NDPK-A相互作用的靶蛋白，旨在為研究NDPK-A的功能和作用機制提供一個新的切入點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒和細胞系 大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、BL21（DE3）為本實驗室保存、質(zhì)粒pBV-NDPK-A由本實驗室構(gòu)建并保存；pGEX-4T-2質(zhì)粒購自上海希匹吉生物公司；肺腺癌細胞株A549由本實驗室儲備。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、T4 DNA連接酶均購自TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自O(shè)mega公司；KOD-Plus-Neo酶購自TOYOBO公司；Glutathione Sepharose 4B凝膠樹脂購自GE Healthcare公司；氨芐青霉素、IPTG、PMSF均購自Sigma公司；完全型蛋白酶抑制劑CPI購自Roche公司；NP40細胞裂解液、BCA試劑盒均購自碧云天生物公司；NDPK-A鼠單抗購自Santa Cruz公司；5 cm分拆式層析柱購自Bio-Rad公司；PCR引物由上海生工生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pGEX-4T-NDPK-A的構(gòu)建 根據(jù)GenBank檢索到的人源NDPK-A全基因序列以及pGEX-4T-2空載的多克隆位點圖譜設(shè)計引物。上游引物為：5'-CGGGATCCATGGCCAACTGTGAGCGTA-3'，下劃線為BamH I酶切位點；下游引物：5'-AGCCGG AATTCTCATTCATAGATCCAGTTCTGAGC-3'，下劃線為EcoR I酶切位點。以含有人源全長目的基因的質(zhì)粒pBV-NDPK-A為模板，進行PCR擴增，條件為：94℃ 2 min；98℃ 10 s，66℃ 30 s，68℃ 30 s，30個循環(huán)；68℃ 5 min。將PCR產(chǎn)物克隆入pGEX-4T-2載體中，PCR及雙酶切鑒定后，交由上海英駿生物公司廣州分公司測序。

1.2.2 GST-NDPK-A融合蛋白的誘導(dǎo)表達 將測序正確的GST-NDPK-A重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，在含氨芐青霉素抗性的固體LB培養(yǎng)基上37℃倒置培養(yǎng)過夜，挑取陽性單克隆，接種于5 mL含氨芐青霉素（100 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩（180 r/min）活化培養(yǎng)過夜。為了盡可能獲得足量的可溶性蛋白用于后續(xù)試驗，將逐級培養(yǎng)活化后的菌液按1∶100的比例接種于300 mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600達到0.6-0.8時，加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，20℃下100 r/min繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜。

1.2.3 GST-NDPK-A融合蛋白的純化、鑒定 離心收集上述誘導(dǎo)菌體，按10∶1（V/V）的比例重懸于 裂 解 緩 沖 液［50 mmol/L Tris-HCl、pH7.6、150 mmol/L NaCl、2 mmol/L EDTA、1% NP40（V/V），及蛋白酶抑制劑CPI和PMSF］中，并加入終濃度為1 mg/mL的溶菌酶，渦旋混勻，冰浴30 min；冰浴超聲裂解15 min后，將破碎液于4℃，14 000 r/min，離心30 min，收集上清。吸取0.5 mL Glutathione Sepharose 4B凝膠珠子混懸液至5 cm的小層析柱內(nèi)，靜置30 min；沉降完全后，加入6倍柱體積的EBC緩沖液清洗平衡純化柱；然后，將收集的細菌裂解液上清過柱；通過使用不同鹽濃度梯度的washing buffer 洗脫雜蛋白；經(jīng)EBC緩沖液平衡柱子后，收集偶聯(lián)有目的融合蛋白的凝膠珠子于0.5 mL的EBC緩沖液中，并直接儲存于分拆式小層析柱內(nèi)。取適量凝膠珠子溶于2×SDS-PAGE buffer中，100℃加熱變性，離心取上清，進行凝膠電泳分析。并以NDPK-A鼠單抗為一抗，鼠源IgG為二抗進行Western blot驗證。

1.2.4 GST-Pull down試驗 在8個100 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)A549細胞，待單層細胞長至約95%融合時，用細胞刮收集細胞于2 mL含有蛋白酶抑制劑的NP40裂解緩沖液中，混勻冰浴裂解40 min，每間隔10 min震動一次。裂解完全后，13 200 r/min，4℃離心30 min，收集上清，即為細胞總蛋白（全細胞裂解液）。BCA法測定蛋白濃度后，立即用于GST- Pull down試驗。

取含GST蛋白的純化珠子與全細胞裂解液在4℃旋轉(zhuǎn)孵育1 h，離心后，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管中，即為預(yù)吸附后的全細胞裂解液。將其均分為2份，一份加入含融合蛋白的純化珠子，另一份加入含GST的純化珠子，根據(jù)BCA法測定的蛋白濃度，調(diào)整加入體積，確保二者珠子上結(jié)合的總蛋白量一致，在4℃下旋轉(zhuǎn)孵育過夜。之后，用預(yù)冷的washing buffer溫和清洗珠子上非特異性結(jié)合的雜蛋白，重復(fù)4次，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，銀染分析。

1.2.5 差異蛋白條帶的酶解及質(zhì)譜鑒定 數(shù)次銀染分析后，鑒定出有重復(fù)性差異的蛋白條帶，繼而將蛋白樣品擴大上樣量，進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色后，從SDS-PAGE膠上切取差異條帶，經(jīng)過常規(guī)的脫色、還原、烷基化、胰酶酶解、肽段萃取等處理，后續(xù)樣本凍干、溶解、Trap柱脫鹽及LC-MS/MS質(zhì)譜分析。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pGEX-4T-NDPK-A的構(gòu)建

以pBV-NDPK-A為模板進行PCR擴增，獲得分子量約500 bp的目的片段（圖1）。將PCR擴增獲得的全長NDPK-A克隆至原核表達載體pGEX-4T-2中，構(gòu)建pGEX-4T-NDPK-A重組質(zhì)粒。挑選陽性單克隆，重組質(zhì)粒提取后，進行PCR鑒定和雙酶切鑒定（圖2）。PCR鑒定獲得一特異性的目的條帶，雙酶切結(jié)果與預(yù)期結(jié)果吻合。測序結(jié)果表明目的片段序列完整且按通讀框方式插入pGEX-4T-2載體中。

圖1 目的基因的PCR擴增

圖2 重組表達質(zhì)粒的鑒定

2.2 GST-NDPK-A融合蛋白的表達、純化

如圖3所示，已成功對可溶性上清分布的融合蛋白GST-NDPK-A、GST蛋白進行誘導(dǎo)表達純化，純度達到90%以上。

2.3 GST-NDPK-A融合蛋白的鑒定

如圖4所示，融合蛋白GST-NDPK-A能發(fā)生特異性的抗原抗體反應(yīng)，具有免疫學(xué)特異性。

2.4 GST-Pull down篩選及復(fù)合蛋白的SDS-PAGE分離

以GST-NDPK-A融合蛋白為誘餌蛋白從A549全細胞裂解液中捕獲的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE電泳后，銀染與考馬斯亮藍染色的結(jié)果（圖5）對應(yīng)顯示，與對照組蛋白帶比較，發(fā)現(xiàn)在25 kD左右處存在明顯的差異蛋白帶，即在A549細胞中找到與NDPK-A潛在性特異結(jié)合和相互作用的蛋白。切取考馬斯亮藍染色的差異蛋白帶并將對照GST蛋白Pull down組中相應(yīng)位置的膠也切下，一起進行LC-MS/MS鑒定。

圖3 GST-NDPK-A蛋白（A）和GST蛋白（B）誘導(dǎo)表達及純化

圖4 融合蛋白GST-NDPK-A的Western blot鑒定

2.5 NDPK-A相互作用蛋白的質(zhì)譜鑒定

LC-MS/MS鑒定出的初級數(shù)據(jù)處理后用Mascot搜索引擎進行IPI human protein database（V3.68）搜庫。結(jié)果（圖6，表1）分析顯示，F(xiàn)ussel-18（functional Smad-suppressing element on chromosome 18）和Rrp12（ribosomal RNA processing 12）成為NDPK-A潛在的體外相互作用蛋白。

圖5 GST-Pull down銀染分析（A）及考染分析（B）

3 討論

尋找互作蛋白能夠為深入揭示NDPK-A在細胞中的功能提供新的依據(jù)和線索。GST-Pull down技術(shù)是體外確定兩個已知蛋白之間是否存在相互作用以及篩選與已知融合蛋白相互作用的未知蛋白的有效方法。因此，本研究構(gòu)建GST-NDPK-A融合蛋白表達載體，以最優(yōu)條件誘導(dǎo)獲得部分可溶性GSTNDPK-A融合蛋白，上清過柱后，親和固化在谷胱甘肽瓊脂糖珠上，此為純化后的誘餌蛋白。而前期經(jīng)Western blot驗證NDPK-A蛋白在肺腺癌A549細胞系中高表達，說明可在此細胞系中尋找NDPK-A的相互作用蛋白。誘餌蛋白與A549細胞裂解液以最佳時間孵育后，捕捉到細胞中有特異性相互作用的目的靶蛋白，最后GST融合蛋白-目的蛋白復(fù)合物一起被谷胱甘肽瓊脂糖珠沉降下來，沉淀的復(fù)合物經(jīng)過SDS-PAGE電泳分離，從電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在25 kD左右處出現(xiàn)新的條帶，說明在A549中成功篩選到了NDPK-A潛在的相互作用蛋白。

圖6 用LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定SDS-PAGE分離的差異蛋白條帶

表1 結(jié)合蛋白的分類

目前蛋白質(zhì)的鑒定常用的有兩種質(zhì)譜分析技術(shù)［8］：其中，MALDI-TOF-MS鑒定蛋白質(zhì)是依靠肽質(zhì)量指紋圖（PMF）來實現(xiàn)，要求待分析的蛋白質(zhì)樣品純度較高，而SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)帶通常含有多個蛋白質(zhì)。并且，對于蛋白質(zhì)分子普遍存在的翻譯后修飾，如多肽側(cè)鏈上的糖基化、磷酸化、乙酰化等化學(xué)修飾，MALDI-TOF-MS無法鑒定，不能獲得多肽序列，造成鑒定結(jié)果準確性不夠。而本研究采用LC-MS/MS鑒定蛋白質(zhì)，通過液相色譜分離多肽片段，樣品不純對分析影響較小，不僅可以準確測定蛋白質(zhì)和肽段的分子量，還能獲得肽段的序列標記及其側(cè)鏈化學(xué)修飾等數(shù)據(jù)，提高了蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果的準確性。此外，我們不僅對GSTNDPK-A融合蛋白Pull down的差異蛋白條帶進行了質(zhì)譜鑒定，而且對相應(yīng)位置處GST標簽Pull down的蛋白亦做了鑒定，以GST標簽Pull down的質(zhì)譜結(jié)果為對照，刪除了一些可能與GST-NDPK-A融合蛋白中的GST標簽結(jié)合的互作蛋白，如：Glutathione S-transferase P，通過試驗過程中GST標簽蛋白的預(yù)吸附和質(zhì)譜鑒定結(jié)果的對照設(shè)定，大大提高了NDPK-A互作蛋白篩選的準確性。

質(zhì)譜鑒定出兩個可能與NDPK-A結(jié)合的相互作用蛋白，分別是Fussel-18（functional Smad-suppressing element on chromosome 18）和Rrp12（ribosomal RNA processing 12），兩者均為文獻中之前未見報道的新的NDPK-A結(jié)合蛋白。NDPK-A廣泛的分布于細胞漿中，少量存在于細胞核、細胞膜、線粒體、微管和組織液中［9］，其功能的發(fā)揮與它在細胞中的定位關(guān)系密切。鑒定到的Fussel-18主要定位于細胞核與細胞質(zhì)，而Rrp12表達于細胞核，這與NDPK-A的分布是相一致的。這說明重組融合蛋白GST-NDPK-A是有功能的，并且適合于招募細胞中存在的相互作用蛋白伙伴。

Fussel-18，屬于癌蛋白Ski家族［10］。研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)系統(tǒng)中，F(xiàn)ussel-18與Smad2和Smad3蛋白相互作用，抑制了TGF-β的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［10］。TGF-β信號的傳遞過程由Smad家族蛋白參與調(diào)控，并與細胞的生長、增殖、分化、凋亡相關(guān)［11，12］。有報道顯示，TGF-β受體的相互作用蛋白之一STRAP（絲蘇氨酸激酶受體相關(guān)蛋白），它通過促進TGF-β受體與Smad7蛋白作用的穩(wěn)定性，實現(xiàn)對TGF-β信號傳遞的抑制［13］。另有研究顯示，NDPK-A與STRAP可以利用半胱氨酸殘基上二硫鍵交聯(lián)的方式，直接結(jié)合互相作用，不僅能夠?qū)TRAP介導(dǎo)的TGF-β信號的抑制作用起到增強效應(yīng)，還能對TGF-β調(diào)節(jié)的凋亡和生長帶來影響［7］。這里暗示NDPK-A通過與STRAP的直接結(jié)合，可能成為TGF-β信號的負調(diào)控者。此外，TGF-β在癌癥生物學(xué)中被認為能夠抑制正常細胞的增殖，反而促進轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞的增殖［14］。這些結(jié)果引導(dǎo)我們提出疑問：NDPK-A介導(dǎo)調(diào)節(jié)TGF-β信號是否與NDPK-A腫瘤轉(zhuǎn)移抑制功能相關(guān)。因此，進一步研究NDPK-A與Fussel-18的相互作用關(guān)系，預(yù)期能更深層次地揭示NDPK-A調(diào)節(jié)TGF-β信號的分子機制及與腫瘤抑制相關(guān)的生物學(xué)功能。

本研究鑒定到的另一個蛋白Rrp12，作為前體40S和60S亞基的一個穩(wěn)定組成部分，參與調(diào)節(jié)核糖體亞基成熟與出口［15］。這暗示著NDPK-A在細胞內(nèi)可能與核糖體組裝有關(guān)。近來研究發(fā)現(xiàn)，Rrp12影響著細胞周期的進程，Rrp12的缺失會導(dǎo)致S期進入障礙、S期以及有絲分裂期的延滯［16］。隨著對細胞周期研究的不斷加深，人們發(fā)現(xiàn)細胞周期紊亂與腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系，并提出“腫瘤可能是一類細胞周期性疾病”。前期研究發(fā)現(xiàn)，NDPK-A可以使宮頸癌細胞Caski和SiHa細胞周期延滯在G1期，并有效抑制細胞增殖［17］。此外，也有報道，Rrp12參與了DNA損傷反應(yīng)的調(diào)節(jié)［16］。在NDPK-A眾多生物學(xué)活性中，3'-5'核酸外切酶活性，與其具備的DNA損傷修復(fù)功能密切相關(guān)［18］。NDPK-A的低表達削弱了DNA損傷修復(fù)功能，基因發(fā)生突變，染色體異常，隨之會發(fā)生細胞癌變。因此，驗證Rrp12與NDPK-A的相互作用關(guān)系，探討這二者在細胞周期及DNA損傷反應(yīng)中的機理與意義，有助于研究它們在腫瘤發(fā)展過程中的生理功能。

通過初步的試驗結(jié)果可知，NDPK-A與Fussel-18及Rrp12在體外可能存在相互作用，但是NDPK-A與這二者在體內(nèi)外的相互作用情況、及具體的結(jié)合區(qū)段，還需要進一步的研究確證，它們相互作用的生物學(xué)功能及意義也有待闡明，這將為基于NDPK-A的藥靶研究增加可靠的試驗及理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)合經(jīng)典分子生物學(xué)與蛋白組學(xué)方法，通過構(gòu)建融合蛋白表達載體、高效誘導(dǎo)可溶性表達、與谷胱甘肽瓊脂糖珠親和層析，實現(xiàn)了GSTNDPK-A的原核表達和純化，并采用GST-Pull down聯(lián)合LC-MS/MS質(zhì)譜分析技術(shù)篩選鑒定到兩個與NDPK-A的互作蛋白，分別為Fussel-18、Rrp12。

［1］ Narayanan R, Ramaswami M. Regulation of dynamin by nucleoside diphosphate kinase ［J］. J Bioenerg Biomembr, 2003, 35（1）：49-55.

［2］ Marino N, Marshall JC, Steeg PS. Protein-protein interactions：a mechanism regulating the anti-metastatic properties of Nm23-H1 ［J］. Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol, 2011, 384（6）：351-362.

［3］ Tseng YH, Vicent D, Zhu J, et al. Regulation of growth and tumorigenicity of breast cancer cells by the low molecular weight GTPase Rad and nm23 ［J］. Cancer Research, 2001, 61（5）：2071-2079.

［4］ Kaul R, Murakami M, Lan K, et al. EBNA3C can modulate the activities of the transcription factor Necdin in association with the metastasis suppressor protein Nm23-H1 ［J］. Journal of Virology, 2009, 83（10）：4871-4883.

［5］ Fan Z, Beresford PJ, Oh DY, et al. Tumor suppressor NM23-H1 is a granzyme A-activated DNase during CTL-mediated apoptosis, and the nucleosome assembly protein SET is its inhibitor ［J］. Cell, 2003, 112（5）：659-672.

［6］ Salerno M, Palmieri D, Bouadis A, et al. Nm23-H1 metastasis suppressor expression level influences the binding properties, stability and function of the Kinase Suppressor of Ras （KSR1） Erk scaffold in breast carcinoma cells ［J］. Molecular and Cellular Biology, 2005, 25（4）：1379-1388.

［7］ Seong HA, Jung H, Ha H. NM23-H1 tumor suppressor physically interacts with serine-threonine kinase receptor-associated protein, a transforming growth factor-beta （TGF-beta）receptor-interacting protein, and negatively regulates TGF-beta signaling ［J］. Journal of Biological Chemistry, 2007, 282（16）：12075-12096.

［8］ 詹顯全, 陳主初. 蛋白質(zhì)組中蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)的研究近況. 國外醫(yī)學(xué)：分子生物學(xué)分冊, 2002, 24 （3）：129-130.

［9］ Urano T, Furukawa K, Shiku H. Expression of nm23/NDP kinase proteins on the cell surface ［J］. Oncogene, 1993, 8（5）：1371-1376.

［10］ Arndt S, Poser I, Schubert T, et al. Cloning and functional characterization of a new Ski homolog, Fussel-18, sepecifically expressed in neuronal tissues ［J］. Laboratory Investigation, 2005, 85（10）：1330-1341.

［11］ Heldin CH, Miyazono K, Ten Dijke P. TGF-beta signalling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins ［J］. Nature, 1997, 390（8）：465-471.

［12］ Elliott RL, Blobe GC. Role of transforming growth factor beta in human cancer ［J］. Journal of Clinical Oncology, 2005, 23（9）：2078-2093.

［13］ Seong HA, Jung H, Choi HS, et al. Regulation of transforming growth factor-β signaling and PDK1 kinase activity by physical interaction between PDK1 and serine-threonine kinase receptorassociated protein ［J］. Journal of Biological Chemistry, 2005, 280（52）：42897-42908.

［14］ Bierie B, Moses HL. TGF-beta and cancer ［J］. Cytokine Growth Factor Rev, 2006, 17（2）：29-40.

［15］ Oeffinger M, Dlakic M, Tollervey D. A pre-ribosome-associated HEAT-repeat protein is required for export of both ribosomal subunits ［J］. Genes Dev, 2004, 18：196-209.

［16］ Dosil M. Ribosome synthesis-unrelated functions of the preribosomal factor Rrp12 in cell cycle progression and the DNA damage response ［J］. Molecular and Cellular Biology, 2011, 31（12）：2422-2438.

［17］ 楊琰, 盧實, 李敏芳, 等.腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因nm23-H1對不同宮頸癌細胞侵襲和增殖的作用［J］.癌癥, 2009, 28（7）：702-707.

［18］ Ma D, McCorkle JR, Kaetzel DM. The metastasis suppressor Nm23-H1 possesses 3’-5’ exonuclease activity ［J］. Journal of Biological Chemistry, 2004, 279（17）：18073-18084.