付暢 王勝楠 郭敏

（哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150025）

同甜土植物相比，鹽生植物具有較強(qiáng)的耐鹽堿能力，其中蘊(yùn)含著豐富的耐鹽堿基因資源，是研究植物耐鹽堿分子機(jī)制和分離耐鹽堿基因的良好材料。星星草（Puccinellia tenuiflora）是禾本科堿矛屬單子葉鹽生草本植物，耐受NaCl的最高濃度可以達(dá)到600 mmol/L，耐受Na2CO3的濃度可以達(dá)到200 mmol/L［1］，能在pH9-10以上的鹽堿地上生長(zhǎng)發(fā)育［2］。對(duì)星星草耐鹽堿性的生理學(xué)研究已經(jīng)獲得了較為系統(tǒng)和全面的認(rèn)識(shí)［1-5］。對(duì)星星草耐受NaHCO3的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答分子機(jī)制的研究也取得了重要的進(jìn)展［6-9］，鑒定了400 mmol/L NaHCO3脅迫條件下星星草基因的表達(dá)譜，以及40 g/L （～476 mmol/L）NaHCO3脅迫下星星草的差異表達(dá)基因。

根是植物抵御鹽堿脅迫的第一道防線，根對(duì)鹽堿脅迫的敏感程度制約著整個(gè)植株的產(chǎn)量［10］。植物感受鹽脅迫信號(hào)后將其轉(zhuǎn)變成引起根部生長(zhǎng)和發(fā)育變化的生理過程。鹽脅迫下轉(zhuǎn)錄因子AP2/EREBP1207和MYB119的表達(dá)水平在整個(gè)根部中的變化微小，而在根尖中卻被強(qiáng)烈誘導(dǎo)［11］。這提示我們，以整株植物為材料分析鹽脅迫下的差異表達(dá)基因，可能會(huì)影響一些根部差異表達(dá)基因的檢測(cè)。因此，根是研究植物鹽堿脅迫應(yīng)答機(jī)制的重要位點(diǎn)。

本研究以鹽堿地上生長(zhǎng)的星星草的根為材料，利用SMART技術(shù)構(gòu)建cDNA文庫(kù)，旨在為揭示星星草耐鹽分子機(jī)制、挖掘星星草耐鹽基因、培養(yǎng)耐鹽植物奠定重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

星星草根采自肇東鹽堿地。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及mRNA的分離 采用改進(jìn)的SDS法［12］從星星草根中提取總RNA，用無RNA酶的DNA酶Ⅰ去除基因組DNA污染，再用RNAclean RNA清潔純化試劑盒（原平皓公司產(chǎn)品）純化總RNA。用Gene Spec V核酸蛋白分析儀測(cè)定總RNA的濃度和純度。用1.2%的瓊脂糖凝膠凝膠電泳檢測(cè) 總RNA的 完 整 性。用PolyATtract?mRNA Isolation Systems（Promega公司產(chǎn)品）從總RNA中分離mRNA。

1.2.2 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 以0.5 μg mRNA為模板，按照CreatorTMSMARTTMcDNA Library Construct ion試劑盒（Clontech公司產(chǎn)品）的說明書操作合成cDNA第一鏈，然后以其為模板通過LD-PCR（Long-distance PCR）擴(kuò)增合成雙鏈cDNA。利用Sfi限制性內(nèi)切酶酶切純化后的雙鏈cDNA，用CHROMA SPIN-400柱對(duì)雙鏈cDNA進(jìn)行分級(jí)分離。將分級(jí)分離后的雙鏈cDNA連接到質(zhì)粒載體pDNR-LIB上。將連接產(chǎn)物以電轉(zhuǎn)化方法（電壓1 800 V、電容25 μF、電阻200 Ω、脈沖時(shí)間5 ms）轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109。

1.2.3 cDNA文庫(kù)質(zhì)量的檢測(cè) 按照CreatorTMSMARTTMcDNA Library Construct ion試劑盒（Clontech公司）說明書操作，測(cè)定文庫(kù)的滴度。挑取轉(zhuǎn)化平板上的菌落，以載體引物M13-f和M13-r進(jìn)行菌落PCR篩選，以確定插入片段的大小和文庫(kù)的重組率。PCR反 應(yīng) 體 系 為：1 μL 10×PCR緩 沖 液，0.8 μL dNTP（2.5 mmol/L），M13-f（10 μmol/L）和M13-r（10 μmol/L）各0.1 μL，0.1 μL rTaq （5 U/μL），用無菌牙簽在轉(zhuǎn)化平板中蘸取菌落作為模板加入反應(yīng)混合物，加滅菌的去離子水至10 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 預(yù)變性4 min；94℃ 30 s，56℃ 30s，72℃ 30 s，作30個(gè)循環(huán)；最后72℃ 延伸10 min。

1.2.4 ESTs的序列測(cè)定與功能注釋 隨機(jī)從平板上挑取25個(gè)陽(yáng)性重組子進(jìn)行測(cè)序，利用NCBI網(wǎng)站上的VecScreen程序去除載體序列，利用Blastx程序在NCBI Nr數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)ESTs序列進(jìn)行相似性比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 鹽堿地星星草根總RNA的提取與純化

按照改進(jìn)的SDS法提取鹽堿地星星草根的總RNA。用DNaseⅠ（RNase-free）對(duì)總RNA進(jìn)行消化，去除基因組DNA的污染，再用RNA清潔純化試劑盒純化消化后的總RNA。瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)結(jié)果（圖1）顯示，28S rRNA與18S rRNA條帶清晰，且其亮度比例達(dá)到2∶1，表明RNA的完整性較好。紫外分光光度法的檢測(cè)結(jié)果顯示，OD260/OD280的比值為2.0，表明RNA的純度較高，可以用于下一步的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

圖1 鹽堿地星星草根總RNA的電泳檢測(cè)

2.2 雙鏈cDNA的合成

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合成的雙鏈cDNA，結(jié)果（圖2）顯示，雙鏈cDNA片段分布在0.5-2 kb之間，表明合成的cDNA雙鏈中具有較多的長(zhǎng)片段，達(dá)到構(gòu)建cDNA文庫(kù)的要求。

圖2 雙鏈cDNA 的LD-PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)

2.3 cDNA文庫(kù)滴度的測(cè)定

按照CreatorTMSMARTTMcDNA Library Construct ion試劑盒說明書的操作，經(jīng)過測(cè)定，擴(kuò)增后文庫(kù)的滴度為1.747×109CFU/mL，已達(dá)到文庫(kù)構(gòu)建庫(kù)容量的要求。

2.4 cDNA文庫(kù)重組率的計(jì)算

從轉(zhuǎn)化平板上隨機(jī)挑取24個(gè)單菌落，以載體引物M13-f和M13-r進(jìn)行菌落PCR。用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的結(jié)果（圖3）顯示，插入片段在0.25-1 kb之間，文庫(kù)的重組率為92%。

圖3 插入片段的檢測(cè)

2.5 cDNA文庫(kù)ESTs的序列測(cè)定與分析

從轉(zhuǎn)化平板上進(jìn)一步挑取單菌落，以載體引物M13-f和M13-r進(jìn)行菌落PCR篩選。隨機(jī)挑取25個(gè)陽(yáng)性重組子進(jìn)行測(cè)序，利用NCBI網(wǎng)站上的VecScreen程序去除載體序列，共測(cè)得20個(gè)ESTs序列。通過Blastx程序在NCBI Nr數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)20個(gè)ESTs序列進(jìn)行同源性比對(duì)的結(jié)果（表1）表明，有8條序列沒有在數(shù)據(jù)庫(kù)中找到相似的序列，9條序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列相似性較低，3條序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的相似性較高。

表1 鹽堿地星星草根cDNA文庫(kù)基因的Blastx分析結(jié)果

3 討論

3.1 鹽堿地星星草根cDNA文庫(kù)的構(gòu)建策略與文庫(kù)質(zhì)量評(píng)價(jià)

本研究采用CreatorTMSMARTTMcDNA Library Construction Kit構(gòu)建了鹽堿地星星草根的cDNA文庫(kù)。采用LD-PCR技術(shù)擴(kuò)增雙鏈cDNA的第二條鏈，可富集文庫(kù)中的低豐度以及稀有基因，提高文庫(kù)的代表性；利用CHROMA SPIN-400柱對(duì)cDNA進(jìn)行分級(jí)分離，可有效除去小片段的cDNA，可富集低豐度的mRNA在文庫(kù)中出現(xiàn)的頻率，一方面保證了文庫(kù)的有效滴度；另一方面提高文庫(kù)的代表性。擴(kuò)增后文庫(kù)的滴度為1.747×109CFU/mL；插入的最大片段為1 kb，插入的片段主要集中在0.75 kb左右；文庫(kù)的重組率為92%。文庫(kù)的質(zhì)量符合構(gòu)建cDNA文庫(kù)的要求。

3.2 cDNA文庫(kù)ESTs序列的初步分析

編號(hào)為CYJDR3-17的EST序列與一粒小麥（Triticum monococcum）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、玉米（Zea mays）、大麥（Hordeum vulgare subsp. Vulgare）和茶樹（Camellia sinensis）等眾多物種的S-腺苷甲硫氨酸合成酶（S-adenosylmethionine synthetase，SAMS）基因的氨基酸序列具有較高的相似性，其中與一粒小麥、二穗短柄草和大麥的相似性達(dá)到100%。SAMS基因編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶，該酶可催化甲硫氨酸與ATP生成S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）。SAM在生物的生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，不僅是激素、核酸、蛋白質(zhì)、磷脂等物質(zhì)合成的甲基供體，還是多胺及乙烯合成的前體物質(zhì)［13］。SAMS在植物逆境生理、衰老生理、植物生物代謝中發(fā)揮重要作用［14］。SAMS基因能被外源乙烯、鹽脅迫、滲透脅迫、氧化脅迫、高溫脅迫、低溫脅迫、鎘脅迫誘導(dǎo)表達(dá)［13，14］，廣泛參與多種逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)。

SAMS基因在植物的鹽脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。鹽脅迫下，SAM參與植物激素、核酸、蛋白質(zhì)和磷脂等物質(zhì)的合成；通過影響多胺和乙烯的含量調(diào)節(jié)植株的耐鹽性；參與植株木質(zhì)化的形成，通過質(zhì)外體途徑調(diào)節(jié)水分運(yùn)輸和離子吸收［13］。鹽脅迫可誘導(dǎo)SAMS基因的表達(dá)，鹽脅迫下黃瓜SAMS基因的表達(dá)呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)［13］。野生大豆SAMS基因在煙草中的超量表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因煙草植株的耐鹽性［14］。SAMS基因是一個(gè)重要的耐鹽相關(guān)基因，我們從鹽堿地星星草根的cDNA文庫(kù)中篩選到的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因2的EST片段，在本研究工作的基礎(chǔ)上可進(jìn)一步通過RACE技術(shù)克隆星星草SAMS2基因的全長(zhǎng)cDNA以及ORF，并鑒定其功能。星星草SAMS2基因的克隆與功能鑒定有助于理解植物逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)，可為該基因的利用提供理論依據(jù)。SAMS2基因可以作為植物耐鹽基因工程的候選工具基因，有望用于培育耐鹽性較強(qiáng)的植物品種，改良和利用鹽堿地。

編號(hào)為CYJDR3-17的EST序列與玉米鈣牽蛋白基因的氨基酸序列具有較高相似性，達(dá)到90%。鈣牽蛋白也被稱為中心體蛋白，是真核生物基本/中心體復(fù)合物的普遍組成成分，是與鈣調(diào)素結(jié)構(gòu)類似的鈣調(diào)EF-hand蛋白。Ko等［15］從1.7 mol/L NaCl條件下生長(zhǎng)的杜氏鹽藻（Dunaliella salina）的cDNA文庫(kù)中分離了鈣牽蛋白基因DsCALT。這些信息表明，鈣牽蛋白與耐鹽性密切相關(guān)。目前關(guān)于植物鈣牽蛋白基因的研究較少，深入研究植物鈣牽蛋白基因的功能，將有助于理解植物的耐鹽分子機(jī)制。

4 結(jié)論

利用SMART技術(shù)構(gòu)建了鹽堿地星星草根的cDNA文庫(kù)。擴(kuò)增后文庫(kù)滴度為1.747×109CFU/mL；插入的最大片段為1 kb，插入的片段主要集中在0.75 kb左右；文庫(kù)的重組率為92%。文庫(kù)的質(zhì)量滿足構(gòu)建cDNA文庫(kù)的要求。從該文庫(kù)中篩選到耐鹽相關(guān)基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶2基因和鈣牽蛋白基因的EST片段，表明該文庫(kù)可用于進(jìn)一步從中篩選星星草耐鹽基因。

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