謝長(zhǎng)林 芮斌 江娜 趙晨 唐雅珺 文漢

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230036；2.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230026）

小GTP酶廣泛地參與真核生物細(xì)胞中的各項(xiàng)生命活動(dòng)，發(fā)揮著十分重要的作用［1］。Arf家族是一類最先被報(bào)道的小GTP酶，主要功能是參與膜運(yùn)輸和細(xì)胞骨架的裝配，其成員包括Arf1-6［2］。其中，Arf6在它的信號(hào)通路中，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架的動(dòng)力學(xué)活性來(lái)實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)生物膜系統(tǒng)的循環(huán)和細(xì)胞骨架的裝配［3］。越來(lái)越多的研究揭示，Arf6還對(duì)胞外分泌的調(diào)節(jié)［4，5］、胞質(zhì)分裂［6］、腫瘤細(xì)胞的遷移［7］、細(xì)胞的吞噬作用［8］發(fā)揮著重要的作用。同其他小GTP酶一樣，一些特異性的GEFs和GAPs調(diào)節(jié)Arf6的活性，和它一起參與到細(xì)胞內(nèi)的各項(xiàng)生命活動(dòng)中。GEF的催化機(jī)制是通過剝落結(jié)合在Arf6上的GDP，使Arf6能夠重新與GTP結(jié)合，并從失活態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚詰B(tài)［9］。

人EFA6家族都是Arf6的GEF，包含4個(gè)成員：EFA6A、EFA6B、EFA6C和EFA6D。EFA6A在腦組織中高表達(dá)，GEF缺陷型EFA6A在神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)上有利于樹突的形成［10］。過表達(dá)EFA6A會(huì)促進(jìn)海馬神經(jīng)元細(xì)胞的神經(jīng)棘生長(zhǎng)［11］。它通過調(diào)節(jié)Arf6和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白的活性，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲［12］。EFA6A在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移中也發(fā)揮作用，另一方面它通過調(diào)節(jié)自身在神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)量來(lái)參與到神經(jīng)細(xì)胞的精加工活動(dòng)中［9］。EFA6A包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域：負(fù)責(zé)定位于膜上的PH結(jié)構(gòu)域、調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架裝配的Coiled-coil Motif結(jié)構(gòu)域和具有催化鳥苷酸交換作用活性的Sec7結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域在EFA6家族中都是十分保守的［13］。

本研究擬從人腦cDNA文庫(kù)中克隆出Sec7結(jié)構(gòu)域的基因序列，再亞克隆至p28a表達(dá)載體中。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21-Gold（DE3）中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，旨在為其結(jié)構(gòu)和功能的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與細(xì)菌 p28a質(zhì)粒：pet28a（Thrombin）改造后的新型載體，宿主菌DH5α和BL21-Gold（DE3）菌、人腦cDNA文庫(kù)。以上均由中國(guó)科技大學(xué)施蘊(yùn)渝教授實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 酶和試劑 Primer Star來(lái)自TaKaRa公司，限制性內(nèi)切酶Nde I、Xho I和T4 DNA連接酶來(lái)自Fermentas公司。質(zhì)粒抽提試劑盒和膠回收試劑盒是OMEGA公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)軟件分析、引物的設(shè)計(jì)與合成 從Uniprot搜索EFA6A的邊界信息，初步選取450-740 aa長(zhǎng)度的氨基酸序列作為Sec7結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的起始片段。依據(jù)Jpred預(yù)測(cè)的結(jié)果，分析PDB（Protein Date Bank）中同源Sec7的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，確定本研究重組表達(dá)的Sec7的邊界為506-719，共214 aa。根據(jù)已測(cè)序的人EFA6A的基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)針對(duì)Sec7基因片段的引物，在上游引物加入Nde I酶切位點(diǎn)，在下游引物中加入Xho I酶切位點(diǎn)，引物由上海英駿有限公司合成。上游引物：5'-ACGTCATATGGAGGACAGCCTTGGGCTGGGGGCAG-3'，下游引物：5'-GCTACTCGAGTCAGCGTCTCAGCTCCTCCTCGTCT-3'（下劃線為Nde I及Xho I酶切位點(diǎn)）。

1.2.2 Sec7基因的克隆 運(yùn)用Touchdown PCR法（程序如表1）從人腦cDNA文庫(kù)中釣取目的基因。程序結(jié)束后用1%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳回收純化目的基因片段。目的基因片段經(jīng)Nde I和Xho I雙酶切后，亞克隆至表達(dá)質(zhì)粒p28a中，16℃過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，卡納抗生素平板篩選后挑取3個(gè)單克隆，將初步鑒定為陽(yáng)性的克隆送至上海華大基因測(cè)序。

1.2.3 Sec7的誘導(dǎo)表達(dá) 比對(duì)測(cè)序結(jié)果，經(jīng)序列吻合的特異性重組子編號(hào)保種。運(yùn)用試劑盒抽提重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21-Gold（DE3）中。挑取單菌落接種于含50 mg/L卡那抗生素的5 mL LB培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)。隔天，1∶20擴(kuò)大培養(yǎng)至100 mL LB中，37℃培養(yǎng)至OD為0.8-0.9后，加入終濃度為0.3 mmol/L IPTG、誘導(dǎo)溫度16℃、時(shí)間24 h。

1.2.4 Sec7的Ni-NTA柱和分子篩純化 目的蛋白誘導(dǎo)24 h后，6 000 r/min離心10 min收菌，50 mL Binding Buffer （20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，pH8.0）重懸菌體后超聲破碎8 min，13 000 r/min離心30 min取上清。當(dāng)離心破碎液時(shí)，再生Ni-NTA柱，待離心結(jié)束后，取上清，流穿Ni-NTA柱。上清流穿結(jié)束后，Binding Buffer洗脫10 mL，Wash Buffer（30 mmol/L imidazole+Binding Buffer）洗脫50 mL，Elution Buffer （300 mmol/L imidazole +Binding Buffer）洗脫20 mL。將含有目的蛋白的Elution溶液濃縮至5 mL，上樣Superdex200柱，目的峰接樣后12%SDS-PAGE蛋白電泳膠查看目的蛋白狀態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)軟件分析結(jié)果

Sec7結(jié)構(gòu)域在GEF-EFA6家族中非常保守，PDB中已知的同源Sec7的結(jié)構(gòu)一般由9-11個(gè)α螺旋組成。Uniprot中提供的Sec7邊界信息為521-706。Jpred預(yù)測(cè)的Sec7結(jié)構(gòu)域邊界為541-716，包含10個(gè)α螺旋，與同源的Sec7的α螺旋數(shù)相符。綜合所有信息學(xué)軟件的分析結(jié)果，為了保證所有的α螺旋能夠被完整表達(dá)，此次試驗(yàn)向N、C兩端各自延長(zhǎng)了數(shù)量不等的氨基酸，最終確定邊界為506-719（圖1）。

圖1 EFA6A的結(jié)構(gòu)域全圖

2.2 Sec7基因的克隆

以人腦cDNA文庫(kù)為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR引物擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在約700 bp左右的地方有一條特異性的DNA條帶（圖2），與預(yù)期的結(jié)果一致。

圖2 PCR電泳結(jié)果

2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建、PCR鑒定和測(cè)序

雙酶切目的片段回收純化后與p28a載體連接，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)DH5α中，過夜37℃培養(yǎng)。挑取3個(gè)單克隆，菌液PCR結(jié)果均為陽(yáng)性克隆（圖3），同時(shí)送樣測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，3個(gè)陽(yáng)性克隆的目的基因序列與Sec7（506-719）基因序列完全吻合。

圖3 菌液PCR鑒定結(jié)果

2.4 Sec7蛋白的Ni-NTA柱、分子篩純化和SDSPAGE電泳分析

將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)BL21-Gold（DE3）細(xì)胞中，誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)Ni-NTA柱純化的蛋白組份跑SDS-PAGE電泳。結(jié)果（圖4）表明，上清液在約25 kD處有一條明顯的特異帶，與目的蛋白分子量基本吻合。從流穿液的電泳結(jié)果來(lái)看，目的蛋白與Ni柱的結(jié)合效果良好，且Elution洗脫液中目的蛋白純度較高。500 mmol/L EDTA洗脫液中沒有發(fā)現(xiàn)目的蛋白的存在，說(shuō)明目的蛋白已經(jīng)被洗脫干凈。

圖4 Ni-NTA柱純化的SDS-PAGE電泳圖

將Elution Buffer的洗脫液濃縮至5 mL，上樣Superdex200柱，波長(zhǎng)280 nm層析圖譜結(jié)果（圖5），接樣后取目的峰的峰尖處蛋白樣品，SDS-PAGE電泳查看蛋白狀態(tài)。

圖5 Sec7蛋白Superdex200分子篩 U280峰圖

盡管Elution的SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，Ni柱純化后的目的蛋白純度較高，但是從波長(zhǎng)280 nm層析圖譜可以看出，在Sec7目的峰出現(xiàn)前仍有較多雜質(zhì)的峰，需要分子篩進(jìn)行后續(xù)純化。將Sec7的目的峰接樣，總體積約為12 mL，取樣SDS-PAGE電泳結(jié)果（圖6）顯示蛋白質(zhì)條帶單一，無(wú)雜帶出現(xiàn)，經(jīng)檢測(cè)蛋白純度高于95%。將分子篩后的樣品，超濾濃縮后至500 μL，目的蛋白濃度為7 mg/mL。蛋白質(zhì)每經(jīng)一次純化理論損失量約為25%，經(jīng)換算，Sec7上清表達(dá)量應(yīng)為70 mg/L（LB液體培養(yǎng)基的體積）。

圖6 分子篩純化SDS-PAGE電泳圖

3 討論

Sec7結(jié)構(gòu)域在EFA6家族里是高度保守的一個(gè)結(jié)構(gòu)域，作為GEF的核心結(jié)構(gòu)域，主要承擔(dān)著催化鳥苷酸交換反應(yīng)的功能。目前的PDB中還沒有EFA6家族Sec7結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)信息，這局限了我們了解Sec7結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及結(jié)構(gòu)與其功能之間的聯(lián)系。

現(xiàn)有的解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法大都建立在得到高純度、穩(wěn)定、均一的重組蛋白的基礎(chǔ)上。運(yùn)用現(xiàn)有的生物信息學(xué)技術(shù)，選擇恰當(dāng)?shù)倪吔?、合適的載體以及相對(duì)應(yīng)的表達(dá)純化方法是獲得理想重組蛋白的重要手段。

本試驗(yàn)在邊界選擇方面綜合了生物信息學(xué)軟件Jpred的預(yù)測(cè)結(jié)果、Uniprot提供的信息和PDB中同源Sec7的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選取適宜的結(jié)構(gòu)域邊界，設(shè)計(jì)引物，通過優(yōu)化PCR的程序，成功從人腦cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增出了Sec7的目的基因片段。根據(jù)后續(xù)的試驗(yàn)結(jié)果顯示，此次邊界的選擇有利于Sec7的高效表達(dá)，突出了現(xiàn)有生物信息學(xué)軟件對(duì)此次試驗(yàn)的指導(dǎo)意義。

試驗(yàn)還使用了一種改造后的新型表達(dá)載體p28a，p28a載體是由pET28a（+）載體改造而來(lái)。pET28a（+）載體表達(dá)的重組蛋白一級(jí)序列為：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM+目的蛋白一級(jí)序列（下劃線為Thrombin酶識(shí)別的氨基酸序列），經(jīng)酶切后的重組蛋白一級(jí)序列為GSHM+目的蛋白。經(jīng)過改造后的p28a載體表達(dá)的重組蛋白一級(jí)序列為：MGHHHHHHM+目的蛋白，N端含有6個(gè)His的標(biāo)簽，用于Ni柱純化，純化后標(biāo)簽無(wú)需酶切，避免了蛋白在酶切時(shí)發(fā)生的沉淀和降解等不利因素，同時(shí)也降低了純化蛋白的經(jīng)濟(jì)成本。

Ni-NTA柱純化后，蛋白狀態(tài)經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)純度較高，但從分子篩的波長(zhǎng)280 nm層析圖譜上看，在目的峰出現(xiàn)以前仍然有很多的雜質(zhì)峰，這不僅反映了SDS-PAGE檢測(cè)方法的缺陷，更突出了分子篩二次純化的必要。后者在起純化作用的同時(shí)，也能反映蛋白的純度、狀態(tài)和穩(wěn)定性，為得到優(yōu)良的蛋白樣品提供了有力保障。

4 結(jié)論

通過優(yōu)化PCR程序成功從人腦cDNA文庫(kù)擴(kuò)增出人EFA6A的Sec7結(jié)構(gòu)域的基因序列。將目的基因片段亞克隆至p28a表達(dá)載體中，測(cè)序結(jié)果與NCBI中的序列完全吻合。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至BL21-Gold（DE3）中，在終濃度0.3 mmol/L IPTG、16℃、24 h情況下成功表達(dá)。重組的Sec7表達(dá)量高（70 mg/L），易于純化，狀態(tài)穩(wěn)定，性質(zhì)均一，純度高于95%。

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