劉 萍， 鄧元俊， 裴廣暢， 許楚甌， 常曉燕， 曾 銳， 姚 穎， 徐 鋼， 韓 敏

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院腎內(nèi)科，武漢 430030

腎間質(zhì)纖維化是各種腎臟疾病進行性發(fā)展至終末期腎病的最后共同途徑，其基本病理變化為腎間質(zhì)肌纖維母細胞產(chǎn)生的細胞外基質(zhì)沉積。腎間質(zhì)肌成纖維細胞有多種可能的來源，包括腎間質(zhì)原位成纖維細胞、周細胞的增殖或活化，腎小管上皮細胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化，毛細血管內(nèi)皮細胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（endothelial to mesenchymal transition，EndoMT），骨髓來源的成纖維細胞的遷移［1－2］。Zeisberg 等［3］發(fā)現(xiàn)在單側(cè)輸尿管梗阻性腎病，鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎病和Alport腎病3種小鼠模型中30%～50%的肌成纖維細胞來源于內(nèi)皮細胞，提示EndoMT 是腎間質(zhì)纖維化的重要機制之一。Li等［4］也證實在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎病中存在EndoMT，參與腎間質(zhì)纖維化的早期進展。一方面，EndoMT 是肌成纖維細胞的重要來源之一；另一方面，內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)分化后，管周毛細血管的屏障功能受損，毛細血管的通透性增加，促進炎性細胞滲出，并導(dǎo)致管周毛細血管網(wǎng)的匱乏及腎間質(zhì)局部缺氧［5］，加重了腎間質(zhì)局部的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，形成炎癥－氧化應(yīng)激－缺氧的微環(huán)境，二者互為因果，相互作用，促進腎間質(zhì)纖維化的進行性發(fā)展［6］。由此可見，EndoMT 是腎間質(zhì)纖維化進展的重要機制之一。

與腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化相似，轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor，TGF－β）可誘導(dǎo)EndoMT 的發(fā)生。Medici等［7］研究證實TGF－β可誘導(dǎo)小鼠胚胎干細胞來源的內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)分化以及Snail的表達，且Snail的表達上調(diào)與TGF－β2誘導(dǎo)的Smad，MEK／ERK，PI3K 以及p38 MAPK 的活化有關(guān)。Chen等［8］研究也表明在系統(tǒng)性硬化的真皮層成纖維細胞中檢測到TGF－β信號通路的活化和ERK1／2 的磷酸化。越來越多的研究也證明MAPK 信號通路在慢性腎臟病的病理進程中起著重要作用［9－10］。然而，MAPK 信號通路的激活是否也參與EndoMT 的發(fā)生迄今尚無報道。本研究旨在明確MAPK 信號通路在TGF－β1 誘導(dǎo)的EndoMT 過程的可能作用。

1 材料和方法

1.1 材料

人臍靜脈內(nèi)皮細胞系（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）購自南京凱基生物有限公司。DMEM／1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶購自南京凱基公司。胎牛血清購自Hyclone 公司。重組人TGF－β1購自R ＆ D 公司。p38 MAPK 抑制劑SB203580、JNK 抑制劑SP600125均購自Sigma公司，ERK1／2特異性抑制劑U0126購自Cell Signaling公司。多克隆兔抗α－SMA 抗體購自Abcam 公司。單克隆小鼠抗VE－cadherin的抗體購自BD 公司，單克隆小鼠抗GAPDH 抗體購自Epitomic公司。CY3和FITC標(biāo)記的熒光二抗購自于Jackson公司，DAPI購自羅氏公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和干預(yù)

HUVECs培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。細胞生長至80%～90%融合狀態(tài)，予0.25%胰蛋白酶消化傳代至6 孔板中。當(dāng)細胞密度達到60%～80%時，無血清化24h后，加入TGF－β1（5ng／mL）刺激0、24、48、72h，并行相關(guān)檢測。抑制劑干預(yù)實驗分組如下：對照組，TGF－β1 模型組，TGF－β1 ＋DMSO組，TGF－β1＋抑制劑組。TGF－β1模型組：予5ng／mL TGF－β1刺激HUVECs 72h；TGF－β1＋DMSO組：予1μL／mL DMSO 干預(yù)HUVECs 30min后，再予5ng／mL TGF－β1刺激細胞72h；TGF－β1＋抑制劑組：予p38 MAPK 特異性抑制劑SB203580（5 mmol／L）或JNK 特異性抑制劑SP600125 （5 mmol／L）或ERK1／2 特異性抑制劑U0126 （10 mmol／L）干預(yù)HUVECs 30 min 后，再加入5ng／mL TGF－β1刺激細胞72h。

1.3 Western blot法檢測細胞蛋白表達

按1.2的方法干預(yù)細胞后，加入RIPA 裂解液裂解細胞，BCA 法進行蛋白定量。10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電印跡轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，封閉1h，再分別與特異性一抗anti－VE－cadherin（1∶300）、anti－α－SMA（1∶1 000）、anti－GAPDH（1∶4 000），4℃，孵育過夜，TBST 漂洗3次，HRP標(biāo)記的二抗，37℃，孵育1h，TBST 清洗3次后，ECL顯影，Quantity One圖像分析軟件測定條帶的灰度值，目的蛋白的相對表達量以目的條帶與對照蛋白（GAPDH）的相對灰度值表達。每組實驗均重復(fù)3次。

1.4 免疫熒光法檢測細胞蛋白表達

細胞以1×105／mL 傳代至底部放有玻片的12孔板，分組為對照組、TGF－β1（5ng／mL）組，72h后經(jīng)PBS 漂洗，予冰甲醇∶丙酮（1∶1）固定細胞，－20℃靜置15min。室溫下，0.5%Triton破膜10 min。5%BSA 室溫封閉30min。分別予anti－VEcadherin（1∶25）、anti－α－SMA（1∶100），4℃，孵育過夜。PBS漂洗后，加入二抗，37℃，避光孵育1h。DAPI（1∶2 000），室溫，避光孵育10 min。封片后，避光保存，鏡檢。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用統(tǒng)計軟件IBM SPSS statistics 19 進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組組間比較采用t檢驗或單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF－β1可誘導(dǎo)HUVECs向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化

分別用TGF－β1（5ng／mL）刺激HUVECs 0、24、48、72h。倒置顯微鏡（×200）觀察細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)：隨著刺激時間的延長，內(nèi)皮細胞逐漸失去其鋪路石樣外觀，呈現(xiàn)出成纖維細胞的梭長形改變（圖1A）。TGF－β1（5ng／mL）刺激HUVECs 72h 后，收獲細胞，應(yīng)用免疫熒光法和Western blot法檢測內(nèi)皮細胞特異性標(biāo)志蛋白VE－cadherin和間充質(zhì)標(biāo)志性蛋白α－SMA 的表達，結(jié)果顯示：與0h 比較，TGF－β1刺激HUVECs 72h后，細胞膜幾乎無內(nèi)皮細胞標(biāo)志性蛋白VE－cadherin的表達，而內(nèi)皮細胞胞質(zhì)內(nèi)間充質(zhì)標(biāo)志性蛋白α－SMA 表達上調(diào)（圖1B）；Western blot結(jié)果也證實TGF－β1 刺激HUVECs 72h后，內(nèi)皮細胞VE－cadherin蛋白表達下調(diào)（P＜0.01），α－SMA 表達顯著性增多（P＜0.05）（圖1C、D）。

2.2 p38 MAPK 的活化對EndoMT的影響

p38MAPK 特異性抑制劑SB203580干預(yù)HUVECs后，內(nèi)皮細胞形態(tài)呈長梭形（圖2A），與TGFβ1模型組和TGF－β1＋DMSO 組比較，細胞形態(tài)無明顯差異。VE－cadherin 和α－SMA 蛋白表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（圖2B）；與對照組比較，VE－cadherin表達顯著性下調(diào)（P＜0.05），α－SMA 表達顯著性上調(diào)（P＜0.05）（圖2C）。

圖1 TGF－β1刺激HUVECs向間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化Fig.1 TGF－β1－induced endothelial－to－mesenchymal transition in HUVECs

圖2 p38 MAPK 特異性抑制劑SB203580干預(yù)HUVECs后細胞形態(tài)和VE－cadherin、α－SMA 蛋白水平的改變Fig.2 The changes of cell morphology and expression of VE－cadherin andα－SMA in HUVECs treated with the p38 MAPK specific inhibitor SB203580

2.3 JNK 的活化對EndoMT的影響

JNK 特異性抑制劑SP600125 干預(yù)HUVECs后，內(nèi)皮細胞形態(tài)呈長梭形（圖3A），與TGF－β1模型組和TGF－β1＋DMSO 組比較，細胞形態(tài)無明顯差異。VE－cadherin和α－SMA 蛋白表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（圖3B）；與對照組比較，VE－cadherin表達顯著性下調(diào)（P＜0.05），α－SMA 表達顯著性上調(diào)（P＜0.05）（圖3C）。

圖3 JNK 特異性抑制劑SP600125干預(yù)HUVECs后細胞形態(tài)和VE－cadherin、α－SMA 蛋白水平的改變Fig.3 The changes of cell morphology and expression of VE－cadherin andα－SMA in HUVECs treated with the JNK specific inhibitor SP600125

2.4 ERK1／2的活化對EndoMT的影響

ERK1／2特異性抑制劑U0126干預(yù)HUVECs后，內(nèi)皮細胞形態(tài)呈鋪路石狀（圖4A），與對照組比較，VE－cadherin和α－SMA 的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖4B）；與TGF－β1模型組和TGF－β1＋DMSO 組比較，VE－cadherin 表達顯著上升（P ＜0.05），α－SMA 表達顯著下降（P＜0.05）（圖4C）。

圖4 ERK1／2特異性抑制劑U0126干預(yù)HUVECs后細胞形態(tài)和VE－cadherin、α－SMA 蛋白水平的改變Fig.4 The changes of cell morphology and expression of VE－cadherin andα－SMA in HUVECs treated with the ERK1／2specific inhibitor U0126

3 討論

腎間質(zhì)纖維化的本質(zhì)被認為是一種“疤痕化”的修復(fù)過程。慢性炎癥的持續(xù)存在刺激肌成纖維細胞的增殖活化，產(chǎn)生大量的細胞外基質(zhì)，沉積于腎間質(zhì)，最終導(dǎo)致腎單位的破壞和腎臟功能的下降［1］。肌成纖維細胞的來源一直備受研究者關(guān)注。有研究認為，腎小管管周毛細血管內(nèi)皮細胞可能是肌成纖維細胞的重要來源之一［3］，尤其在以血管病變?yōu)橹鞯奶悄虿∧I病中，內(nèi)皮細胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化可能是肌成纖維細胞的重要來源，參與腎間質(zhì)纖維化的進行性發(fā)展［4］。然而，目前對于調(diào)控內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)分化的信號通路和轉(zhuǎn)錄機制的研究甚少，闡明腎小管管周毛細血管EndoMT 的信號調(diào)控途徑將為探尋腎間質(zhì)纖維化治療的新靶點提供實驗依據(jù)。

TGF－β1是腎間質(zhì)纖維化進展的關(guān)鍵調(diào)控因子［7，11－12］。與腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化過程相似，TGF－β1也可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化。既往的研究表明，EndoMT 參與胚胎心臟瓣膜發(fā)育，而在此過程中檢測到TGF－β1信號通路的活化［13］。本研究應(yīng)用TGF－β1誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化，結(jié)果顯示：TGF－β1（5ng／mL）刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞72h，不僅可使其形態(tài)發(fā)生變化而且內(nèi)皮細胞標(biāo)志性的粘附連接蛋白VE－cadherin表達下調(diào)，α－SMA 蛋白其表達上調(diào)，與0h 相比均存在統(tǒng)計學(xué)差異；細胞免疫熒光結(jié)果進一步證實這一現(xiàn)象。提示TGF－β1誘導(dǎo)HUVECs向間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化的細胞模型制作成功，可用于EndoMT 的相關(guān)細胞研究。

大量的研究表明，MAPK 信號通路參與腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的過程。本實驗室既往的研究也表明：信號素蛋白Semaphorin 4C通過p38 MAPK 途徑參與調(diào)控腎小管上皮細胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化［14］；Erbin作為腎小管上皮細胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化的負性調(diào)節(jié)劑，主要通過ERK 1／2信號途徑發(fā)揮作用［15］。在EndoMT 過程中，本研究結(jié)果顯示：ERK1／2 信號通路參與調(diào)節(jié)TGF－β1誘導(dǎo)的HUVECs轉(zhuǎn)分化。ERK1／2特異性抑制劑U0126可以顯著減輕TGFβ1誘導(dǎo)的α－SMA 蛋白的表達上調(diào)，維持VE－cadherin在內(nèi)皮細胞的表達；而抑制JNK 和p38 MAPK信號通路的活化對TGF－β1誘導(dǎo)的HUVECs轉(zhuǎn)分化無顯著影響。Medici等［16］的研究表明：TGF－β2刺激的EndoMT 過程，主要通過Smads信號通路和非Smads信號通路（包括MEK／ERK，PI3K 和p38 MAPK 信號通路）實現(xiàn)。IL－1β和TGF－β2協(xié)同誘導(dǎo)EndoMT 的過程中，Maleszewska等［17］的研究提示轉(zhuǎn)錄因子NF－κB是必不可少的。Li等［18］關(guān)于大鼠肺間質(zhì)內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)分化研究則提示：c－Abl激酶和PKCδ是TGF－β1誘導(dǎo)的EndoMT 的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。由此可見，在不同的組織中EndoMT 的信號調(diào)控通路可能不盡相同，Smads 通路、MAPK 通路（如ERK1／2通路）等多種通路均參與其中［19－20］。

盡管本研究已初步證實ERK1／2 信號通路是內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一，但是本研究僅應(yīng)用化學(xué)性信號通路的特異性抑制劑進行干預(yù)，存在一定的局限性，需進一步應(yīng)用siRNA 和質(zhì)粒等生物學(xué)技術(shù)進一步驗證該信號通路對EndoMT 發(fā)生的影響，另外還需要在體內(nèi)實驗進行驗證。另外，本實驗尚未檢測TGF－β／Smads信號通路的活化及轉(zhuǎn)錄因子的表達情況，Smads 信號通路是否與ERK1／2信號途徑協(xié)同，參與EndoMT 的發(fā)生，還需要在后續(xù)的研究中進一步論證。

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