黃小妹， 陳文莉， 袁靜萍， 楊月紅， 王 銀， 胡曉松， 曾星若， 方 詢

武漢市中心醫(yī)院1腎病科2病理科，武漢 430014

近日節(jié)律是生物體24h當(dāng)中生理及行為的變化規(guī)律。在哺乳動(dòng)物，近日節(jié)律的控制器——時(shí)鐘基因主要在視上核交叉系統(tǒng)（suprachiasmatic nucleus，SCN），近年研究認(rèn)為在外周組織如心肌細(xì)胞、肝臟、腎臟等也有時(shí)鐘基因的表達(dá)，并與生物體的生理及病理變化有關(guān)系。目前已發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物時(shí)鐘基因包括周期基因1－3（period1－3，per1－3）、羥受體核轉(zhuǎn)位蛋白基因（brain and muscle Arnt－Like protein－1，bmal1）、時(shí)鐘基因（clock）、隱花色素基因（cryptochrome，cry），以及時(shí)鐘輸出基因白蛋白Dbox 結(jié)合蛋白基因（Albumin D－element－binding protein，dbp）等［1－3］。

血管緊張素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，AngⅡ）作為一種授時(shí)因子可以誘導(dǎo)外周組織時(shí)鐘基因的表達(dá)［4－5］，并且作為腎素－血管緊張素系統(tǒng)（renin－angiotensin system，RAS）中的重要成員在慢性腎?。╟hronic kidney disease，CKD）的病理和發(fā)病機(jī)制中起重要作用。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（Angiotensin－converting enzyme inhibitor，ACEI）不僅抑制循環(huán)中AngⅡ活性，還抑制腎組織局部AngⅡ的活性。本研究擬用ACEI類藥物苯那普利治療5／6腎切除大鼠（5／6subtotal nephrectomy，STNx），觀察其對(duì)腎組織時(shí)鐘基因per2、bmal1及dbp 及其蛋白產(chǎn)物表達(dá)節(jié)律的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠95只，體重200～220 g，由湖北省疾控中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并飼養(yǎng)于SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑

兔抗大鼠PER2 多克隆抗體（sc－25363，美國(guó)Santa Cruz公司），兔抗大鼠DBP 多克隆抗體（sc－98411，美國(guó)Santa Cruz公司）及兔抗BMAL1多克隆抗體（sc－48790，美國(guó)Santa Cruz公司），苯那普利（北京諾華制藥有限公司，x1483），AngⅡ放免試劑盒（碘125放射免疫分析藥盒，北京科美東雅）。所用引物per2，bmal1及dbp及內(nèi)參18sRNA 的基因序列通過(guò)GenBank獲得，見(jiàn)表1。

1.3 造模及分組

Wistar大鼠先適應(yīng)性喂養(yǎng)7d，隨機(jī)分為3組，假手術(shù)組（30 只），5／6 腎大部切除組（模型組，32只），苯那普利治療組（BM 組，33只）。造模方法參見(jiàn)以往報(bào)道［6－7］。

1.4 取標(biāo)本

造模后次日將大鼠置于12h－12h明暗交替的環(huán)境飼養(yǎng)。7AM 開(kāi)燈，7PM 關(guān)燈。7AM 記為ZT0時(shí)，8AM 記為ZT1時(shí)，依次類推。造模次日苯那普利治療組每天早上7AM （ZT0）用苯那普利10mg／kg灌胃，其余兩組用等量生理鹽水灌胃。大鼠自由進(jìn)食及飲水。造模后第11周留取24h尿標(biāo)本檢測(cè)尿蛋白定量。第12 周處死大鼠。分別在7AM（ZT0），11AM（ZT4），3PM（ZT8），7PM（ZT12），11PM（ZT16），3AM（ZT20）各時(shí)間點(diǎn)3組各處死5只大鼠，取出腎組織及血標(biāo)本。腎組織標(biāo)本用冰鹽水灌洗后置于凍存管中，立即置于液氮罐中，再轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱保存?zhèn)錂z，檢測(cè)前將腎組織取出，制備組織均漿。血標(biāo)本置于肝素鈉抗凝管中用于檢測(cè)腎功能。

表1 引物序列Table 1 Primer Sequences

1.5 放免檢測(cè)

放免法檢測(cè)AngⅡ。檢測(cè)前將腎組織取出，制備組織均漿。分別檢測(cè)血漿及腎組織均漿中AngⅡ濃度（pg／mL）。由武漢大學(xué)附屬湖北省人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科檢測(cè)。

1.6 real－time PCR檢測(cè)

檢測(cè)腎組織per2，bmal1及dbp基因mRNA 表達(dá)。檢測(cè)方法參見(jiàn)以往報(bào)道［6－7］。

1.7 Western blot檢測(cè)

剪取全腎組織約200mg，加入50μL蛋白裂解液，制備腎組織勻漿，12 000g、4℃，離心30 min。取1μL上清加入99μL 三蒸水中混勻，加500μL考馬斯亮藍(lán)混勻，10 min后測(cè)濃度，取余下上清與樣品緩沖液混合。中高火煮沸7 min，放入－80℃凍存。檢測(cè)時(shí)將樣本點(diǎn)在SDS－聚丙酰胺凝膠跑膠，初用60V 跑膠，待跑至分離膠后改用100V，直到溴酚藍(lán)接近跳水。用PVDF 膜轉(zhuǎn)膜，350 mA 30 min。室溫條件下，5%脫脂奶粉封閉1h，放在搖床上搖，封一抗，4℃過(guò)夜；室溫復(fù)溫20 min PBST 洗膜1h（搖床上搖），封二抗。PBST 洗膜（搖床上搖）1～3h，BCIP∶NBT∶AP buffer按1∶1∶250配成4mL在小皿里避光顯色，以β－actin為內(nèi)參，計(jì)算相對(duì)吸光度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0及Matlab7.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間資料比較采用雙因素方差分析（two－way ANOVA）。當(dāng)時(shí)鐘基因mRNA 表達(dá)符合近日節(jié)律時(shí)，采用Halberg 余弦法（cosinor）分析，當(dāng)檢測(cè)指標(biāo)不符合余弦函數(shù)時(shí)，用非配對(duì)t檢驗(yàn)（unpaired ttest）。研究血漿及腎組織中AngⅡ與腎組織時(shí)鐘基因及時(shí)鐘基因蛋白相關(guān)性時(shí)采用Spearman相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎功能及24h尿蛋白定量

5／6 腎大部切除大鼠（模型組）12 周時(shí)腎功能BUN、Scr明顯高于假手術(shù)組，尿蛋白排泄量也明顯高于假手術(shù)組，苯那普利（BM 組）治療后BUN、Scr及尿蛋白排泄量低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明12周時(shí)慢性腎衰模型制備成功，苯那普利能改善腎功能，具有腎保護(hù)作用，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腎功能及24h尿蛋白定量（±s，n＝5）Table 2 BUN，Scr and 24－h(huán) urine protein excretion in each group（±s，n＝5）

表2 各組大鼠腎功能及24h尿蛋白定量（±s，n＝5）Table 2 BUN，Scr and 24－h(huán) urine protein excretion in each group（±s，n＝5）

與假手術(shù)組比較，＊P＜0.01；與BM 組比較，＃P＜0.01

組別 BUN（mmol／L） Scr（mmol／L） 24h尿蛋白定量（mg）假手術(shù)組8.2±1.9 35.2±7.4 4.1±1.5模型組28.5±7.6＊＃ 131.2±24.5＊＃73.8±11.4＊＃BM 組16.9±5.3＊92.4±17.9＊32.7±5.3＊

2.2 各組大鼠循環(huán)及腎組織AngⅡ的表達(dá)節(jié)律

假手術(shù)組腎AngⅡ谷（T）、峰值（P）時(shí)間分別在ZT12、ZT4，P／T 為8.48；模型組ZT4 時(shí)達(dá)峰值，ZT12～ZT20 等時(shí)間均在谷值附近波動(dòng)，P／T 為9.08。用苯那普利治療后腎AngⅡ水平明顯降低，振幅減弱，P／T 為4.74。假手術(shù)和模型組間腎AngⅡ水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＝0.306），BM 組腎AngⅡ水平明顯低于假手術(shù)和模型組（P＝0.012）；各組不同時(shí)間點(diǎn)腎AngⅡ表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），見(jiàn)圖1A。血漿AngⅡ水平假手術(shù)組谷、峰值時(shí)間分別為ZT0、ZT20，P／T 為1.51；模型組峰值提前至ZT16，P／T 為1.95；BM 組用苯那普利治療后血漿AngⅡZT4～ZT20均在低水平波動(dòng)，明顯低于假手術(shù)和模型組（P＜0.05），谷、峰值點(diǎn)分別在ZT4、ZT0，P／T 為3.41。各組不同時(shí)間點(diǎn)血漿AngⅡ節(jié)律有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＝0.018），見(jiàn)圖1B。

將圖1A 與圖1B結(jié)合看，腎局部AngⅡ節(jié)律與血漿中不一致：假手術(shù)組與模型組的腎組織及血漿AngⅡ在各時(shí)間點(diǎn)的波動(dòng)趨勢(shì)相反，而且AngⅡ在腎局部的水平明顯高于血漿。

圖1 各組腎組織（A）及血漿（B）AngⅡ節(jié)律Fig.1 Daily profile of AngⅡin the kidney（A）and plasma（B）in each group

2.3 各組大鼠各時(shí)點(diǎn)時(shí)鐘基因mRNA 表達(dá)

見(jiàn)圖2。假手術(shù)組合模型組bmal1 mRNA 谷峰值點(diǎn)相同，模型組per2 mRNA 峰值時(shí)間提前4 h；BM 組bmal1 mRNA 峰值時(shí)間后移4h；dbp 及per2mRNA 近日節(jié)律消失。具體描述見(jiàn)以往報(bào)道［6－7］。

2.4 各組大鼠各時(shí)點(diǎn)BMAL1、DBP、PER2蛋白表達(dá)

BMAL1蛋白假手術(shù)組谷值（T）時(shí)間在ZT0時(shí)，隨后表達(dá)逐漸增強(qiáng)，在ZT12達(dá)到峰值（P），P／T為2.88；而模型組峰值時(shí)間提前到ZT8，振幅增強(qiáng)，P／T 為38.34；BM 組表達(dá)趨勢(shì)及谷、峰值時(shí)間與假手術(shù)組相似，P／T 為3.16，各組不同時(shí)點(diǎn)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。DBP 蛋白假手術(shù)組自ZT0到ZT16時(shí)均在較高水平表達(dá)，谷、峰值時(shí)間分別在ZT20及ZT8 時(shí)，P／T 為12.29；模型組谷、峰值時(shí)間與假手術(shù)組相同，但表達(dá)水平增強(qiáng)，振幅明顯增加，P／T 為103.2；與假手術(shù)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.028）；BM 組DBP 表達(dá)趨勢(shì)及谷、峰值時(shí)間也與假手術(shù)組相似，P／T 為21.23，各組不同時(shí)點(diǎn)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PER2假手術(shù)組谷、峰值時(shí)間分別在ZT16、ZT4，P／T 為8.79，模型組谷、峰值時(shí)間均前移4h，分別在ZT12及ZT0，P／T 為9.33，而B(niǎo)M 組PER2谷、峰值時(shí)間與模型組相似，P／T 為11.28；各組不同時(shí)點(diǎn)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖2 各組時(shí)鐘基因bmal1、dbp及per2mRNA 表達(dá)節(jié)律（real－time PCR）Fig.2 Daily profile of bmal1，dbp and per2mRNA expression in the kidney in each group（real－time PCR）

圖3 各組時(shí)鐘蛋白BMAL1、DBP及PER2的表達(dá)節(jié)律（Western blot）Fig.3 Daily profile of the expression of BMAL1，DBP and PER2proteins in the kidney in each group（Western blot）

2.5 各組大鼠血漿及腎AngⅡ、腎時(shí)鐘基因mRNA及時(shí)鐘基因蛋白24h表達(dá)節(jié)律的余弦分析

各組腎AngⅡ呈現(xiàn)近日節(jié)律，BM 組腎AngⅡ峰值位相較假手術(shù)和模型組后移約6h；假手術(shù)和模型組時(shí)鐘基因per2、bmal1mRNA 表達(dá)呈近日節(jié)律，BM 組per2 mRNA 近日節(jié)律消失，bmal1峰值位相后移4h；3組dbp mRNA 節(jié)律不符合余弦規(guī)律；3組時(shí)鐘蛋白PER2、DBP、BMAL1均表現(xiàn)出近日節(jié)律，其中模型組DBP、BMAL1 振幅增強(qiáng)，峰值位相各組也有區(qū)別，見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠腎時(shí)鐘基因mRNA 24h表達(dá)節(jié)律的余弦分析Table 3 Cosinor analysis of 24－h(huán) pattern of clock gene mRNA and protein expression in each group

續(xù)表

2.6 相關(guān)分析

將血漿及腎組織中AngⅡ與組織中per2、bmal1及時(shí)鐘基因蛋白PER2、BMAL1、DBP 行Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組和模型組腎組織AngⅡ與腎時(shí)鐘基因bmal1呈正相關(guān)，rs＝0.532，P＝0.015，其余指標(biāo)無(wú)相關(guān)性。

3 討論

腎組織中時(shí)鐘基因的表達(dá)呈近日節(jié)律，蛋白質(zhì)表達(dá)的峰值時(shí)間比mRNA 滯后4～8h。腎組織中時(shí)鐘基因蛋白的近日節(jié)律與腎臟生理功能的近日節(jié)律性比較吻合：如腎小球?yàn)V過(guò)率（GFR）及腎血流量的峰值在17∶00，谷值時(shí)間在5∶00［8－9］，與BMAL1及DBP的谷峰值時(shí)間較為吻合；腎臟電解質(zhì)排泄（如尿鉀、尿鈉排泄）白天（8∶00～16∶00）明顯高于夜晚［10］，這與PER2 及DBP 的表達(dá)水平及時(shí)間也比較吻合。我們的結(jié)果說(shuō)明腎臟生理功能的近日節(jié)律性是受腎內(nèi)在的時(shí)鐘基因控制的。

5／6腎切除大鼠時(shí)鐘基因及其蛋白質(zhì)表達(dá)節(jié)律及水平發(fā)生改變。在蛋白質(zhì)水平，5／6 腎切除大鼠PER2 的谷、峰值時(shí)間均提前4h，而B(niǎo)MAL1 及DBP的振幅明顯增加。慢性腎衰時(shí)腎臟功能表現(xiàn)出的異常節(jié)律與時(shí)鐘基因及其蛋白質(zhì)的近日節(jié)律及表達(dá)水平發(fā)生變化有關(guān)。國(guó)外學(xué)者證實(shí)clock基因敲除小鼠或dbp／hlf／tef缺乏小鼠在涉及水、鈉平衡的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子如血管加壓素V2受體、水通道－2、水通道－4等的表達(dá)發(fā)生改變，相應(yīng)地表現(xiàn)出糖尿病性尿崩癥、鈉排泄失調(diào)及低血壓等［11］。而涉及電解質(zhì)及酸堿平衡的關(guān)鍵NHE3 是直接受腎內(nèi)clock：bmal1 異質(zhì)二聚體調(diào)節(jié)的時(shí)鐘控制基因，在CRY1／2（－／－）小鼠NHE3 近日節(jié)律表達(dá)被阻斷［12］。

以往的研究證實(shí)，循環(huán)RAAS 存在近日節(jié)律［13－14］。本研究證實(shí)，腎組織AngⅡ存在近日節(jié)律，而且腎AngⅡ節(jié)律與循環(huán)節(jié)律不相同，假手術(shù)及模型組血漿及腎局部AngⅡ的谷峰趨勢(shì)相反。苯那普利治療后血漿及腎組織中AngⅡ水平明顯下降，說(shuō)明ACEI藥物對(duì)循環(huán)及組織中AngⅡ水平均有明顯抑制作用，并改變了其表達(dá)節(jié)律性。

腎局部AngⅡ與腎臟近日節(jié)律系統(tǒng)之間有相關(guān)性。中樞性時(shí)鐘基因與外周組織時(shí)鐘基因的分子學(xué)機(jī)制相同，但是授時(shí)因子不同。中樞節(jié)律系統(tǒng)（SCN）的授時(shí)因子是光線，而外周器官節(jié)律器的授時(shí)因子是神經(jīng)內(nèi)分泌因子［15－16］。用原代細(xì)胞培養(yǎng)體系，Nonaka等［5］已證實(shí)AngⅡ是血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)近日節(jié)律器的授時(shí)因子，另有一些研究提示AngⅡ是通過(guò)血管緊張素1型或2型受體（AT1／2－R）影響中樞或外周組織近日節(jié)律系統(tǒng)［3－4］。本文用在體動(dòng)物研究循環(huán)及腎組織局部AngⅡ與腎臟時(shí)鐘基因表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，循環(huán)AngⅡ水平及節(jié)律與腎組織時(shí)鐘基因bmal1、per2 及dbp 及其蛋白BMAL1、PER2、DBP之間無(wú)關(guān)；而腎局部AngⅡ水平及節(jié)律與bmal1 mRNA 表達(dá)水平及節(jié)律呈正相關(guān)：腎組織AngⅡ及bmal1 mRNA 表達(dá)趨勢(shì)及其谷、峰值時(shí)間均一致。用苯那普利抑制腎組織AngⅡ水平后，bmal1 的峰值后移。腎組織AngⅡ與per2 mRNA 的表達(dá)趨勢(shì)相反，但是其峰值時(shí)間與per2mRNA 谷值時(shí)間相差4h，提示兩者之間有一定關(guān)聯(lián)。我們的結(jié)果提示腎局部AngⅡ與腎臟近日節(jié)律系統(tǒng)間的相關(guān)性，而循環(huán)AngⅡ?qū)δI時(shí)基因影響不大，但腎AngⅡ與近日節(jié)律系統(tǒng)之間的因果關(guān)系還不清楚。我們猜測(cè)5／6腎切除大鼠腎組織中異常的AngⅡ節(jié)律及水平作為內(nèi)部授時(shí)因子通過(guò)AT1／2型受體影響腎組織近日節(jié)律系統(tǒng)，而腎近日節(jié)律系統(tǒng)發(fā)生改變后通過(guò)時(shí)鐘控制基因等途徑改變其下游靶基因的近日節(jié)律性，并最終導(dǎo)致腎臟的各項(xiàng)功能發(fā)生變化。

本研究中dbp mRNA 不符合余弦曲線表達(dá)形式。dbp表達(dá)最豐富的組織不是腎臟而是肝臟，而不同組織中時(shí)鐘基因的表達(dá)節(jié)律及水平會(huì)有差別，以后的研究需進(jìn)一步深入。

值得注意的是，我們用苯那普利抑制腎臟AngⅡ水平后發(fā)現(xiàn)腎臟時(shí)鐘基因及時(shí)鐘基因蛋白的表達(dá)節(jié)律及時(shí)相發(fā)生變化，但是mRNA 與蛋白的變化不同：per2及dbp的mRNA 表達(dá)節(jié)律性消失，bmal1的峰值后移4h，近日節(jié)律性仍保持；但是，PER2及DBP蛋白表達(dá)仍維持近日節(jié)律性。我們推測(cè)原因可能有以下幾點(diǎn)：bmal1、per2及dbp的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)還有除AngⅡ外的其他因素參與；腎時(shí)鐘基因系統(tǒng)的調(diào)節(jié)還受中樞神經(jīng)系統(tǒng)［17］及其他內(nèi)分泌因子如糖皮質(zhì)激素［18］以及RAAS 系統(tǒng)其他組分的影響；AngⅡ除是腎時(shí)鐘基因的授時(shí)因子外，其本身表現(xiàn)出的近日節(jié)律性很可能也是時(shí)鐘基因控制基因的產(chǎn)物，從而與時(shí)鐘基因形成反饋環(huán)。對(duì)此我們將進(jìn)一步深入研究。

致謝：感謝武漢大學(xué)生命科學(xué)院鄭凌教授對(duì)本研究的大力幫助；感謝EYE 統(tǒng)計(jì)工作室段凌對(duì)本研究提供的統(tǒng)計(jì)幫助。

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