高亞雄，李 蕓，畢小平，趙正保

(1.山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，山西 太原 030001;2.山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西 太原 030001)

消渴降糖膠囊的主要原料為番石榴葉。番石榴葉中主要化學(xué)成分有黃酮類化合物、鞣質(zhì)類化合物、揮發(fā)油、植物固醇、葉綠素和多糖等［1，2］，其中黃酮類化合物以其廣泛的藥理作用倍受關(guān)注。近10 年來，有關(guān)黃酮類化合物的文獻(xiàn)成指數(shù)增加，研究發(fā)現(xiàn)黃酮具有抗心腦血管病、抗氧化、鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、緩解糖尿病并發(fā)癥等作用。本實驗采用硝酸鋁比色法測定總黃酮的含量，以蘆丁為對照品，5%亞硝酸鈉、10%硝酸鋁和5%氫氧化鈉溶液的用量分別為400 μL、400 μL、5 mL，顯色時間20 min，于500 nm波長處測定消渴降糖膠囊提取物總黃酮的吸光度，并計算濃度及含量。在確定含量測定方法的前提下，實驗進(jìn)行了精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率的實驗考查，證明該含量測定方法的準(zhǔn)確可靠性，以及提取樣品的穩(wěn)定性。

1 材料與儀器

1.1 材料

消渴降糖膠囊為山西華康藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號:20091001，20091002，20091003 ;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為中國藥品生物制品檢定所生產(chǎn)，批號:0080－9705;亞硝酸鈉氫氧化鈉為天津市津北精細(xì)化工有限公司生產(chǎn);硝酸鋁為天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司生產(chǎn)。

1.2 儀器

UV-9100 紫外可見分光光度計(北京瑞利分析儀器公司)，TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)，KMD 型可調(diào)電子控溫電熱套(山東省鄄城縣新華儀器廠)，電子天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司)，數(shù)字恒溫水浴鍋(常州國體電器有限公司)，日本島津SHIMADZU 電子天平AUY120。

2 方法與步驟

2.1 含量測定方法

采用硝酸鋁比色法。以蘆丁作對照，于500 nm波長處測定［3，4］。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液制備 取裝量差異項下的本品內(nèi)容物，混勻，精密稱定0.1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇溶液25 mL溶解，密塞，稱定重量，于75 ℃超聲處理(70 W，40 kHz)60 min，放冷，再稱定重量，用50%乙醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻、抽濾，再經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液即得，備用。

2.2.2 對照品儲備液的制備 精密稱取蘆丁對照品20 mg，置于10 mL的具塞刻度試管中，加入95%的乙醇溶液6.0 mL，微熱使其溶解。再用95%的乙醇定容至刻度，搖勻，得到濃度為2.0 mg/mL的蘆丁對照儲備液，臨用前稀釋成0.2 mg/mL。

2.3 影響因素考察

2.3.1 最大吸收波長的選擇 取適量蘆丁對照品溶液，在400 ～650 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，測得的最大吸收波長為500 nm。見圖1。

圖1 蘆丁對照品的吸收光譜Fig 1 Absorption Spectrometry of Control Substance of Rutin

2.3.2 亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉用量考察 采用單因素考察法，以蘆丁為對照品，95%的乙醇為溶劑，在500 nm處測定其吸光度，分別考察5% 亞硝酸鈉、10%硝酸鋁、5%氫氧化鈉溶液的用量，確定各自最佳體積。見表1 ～3。

表1 顯示，當(dāng)亞硝酸鈉體積是400 μL時，吸光度值最大，所以，亞硝酸鈉用量選擇400 μL為宜。

表2 顯示，當(dāng)硝酸鋁用量是400 μL時，吸光度最大，所以，硝酸鋁用量選擇400 μL為宜。

表3 中1 號試管生成紅色絮狀物，非透明澄清溶液，不穩(wěn)定，無法測得吸光度，所以只用了2 ～7 號試管。表3 顯示，隨著氫氧化鈉用量的增加，吸光度先增加后減小，當(dāng)氫氧化鈉用量達(dá)5.0 mL時，吸光度值最大，所以，氫氧化鈉用量5.0 mL為宜。

2.3. 3 顯色時間考察 取濃度為0.024 mg/mL 和0.040 mg/mL的蘆丁對照品溶液，按照含量測定項下操作，室 溫 放 置0 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min，500 nm波長處測定吸光度，進(jìn)行穩(wěn)定性實驗，結(jié)果見表4。表4 顯示，顯色時間在20 min后，吸光度值基本不變，因此確定顯色時間為20 min。

表1 亞硝酸鈉用量的影響Table 1 Effect of the Dosage of Sodium Selenite

表2 硝酸鋁用量的影響Table 2 Effect of the Dosage of Aluminum Nitrate

表3 氫氧化鈉用量的影響Table 3 Effect of the Dosage of Sodium Hydroxide

表4 不同濃度吸光度顯色時間比較Table 4 Comparison of Absorption Coloration Time in Different Concentrations

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取濃度為0.2 mg/mL的蘆丁對照品溶液0 mL、0.4 mL、1.2 mL、2.0 mL、3.2 mL、4.0 mL，分別置于編號為0 ～5 的10 mL具塞試管中，再分別加入5%亞硝酸鈉溶液400 μL，混勻，放置6 min，再加10%硝酸鋁溶液400 μL，放置6 min，再加5% 氫氧化鈉溶液5.0 mL，最后用95%的乙醇定容至刻度，搖勻，20 min后，以0 號為空白，在500 nm處測定其吸光度。

以蘆丁的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，得回歸方 程 為:y = 11. 301x + 0. 012，(n= 5)，蘆 丁 在0.008 ～0.080 mg/mL范圍內(nèi)線性良好，R=0.996 9。結(jié)果見圖2。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 2 Rutin Standard Curve

2.5 精密度試驗

取高、中、低3 種不同濃度對照品溶液，按照含量測定方法項下操作，于日內(nèi)8:00，12:00，20:00 測定其吸光度，結(jié)果見表5。

表5 日內(nèi)精密度結(jié)果Table 5 Precision Result in a Day

由表5 可知，高、中、低3 濃度的日內(nèi)精密度試驗測定結(jié)果的RSD 為1.4% ～2.0%。結(jié)果表明，該方法的日內(nèi)精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

精密稱取批號為20091001 的消渴降糖膠囊樣品，按供試品溶液制備方法制備，室溫放置，分別于0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、12 h進(jìn)行測定，結(jié)果見表6。

表6 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 6 Test Result of Stabilization

表6 顯示，12 h 內(nèi)，測定結(jié)果為均值0.417 ±0.008，RSD 為2.0%，表明供試液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定，可以滿足測定要求。

2.7 重復(fù)性實驗

精密稱取同一批號為20091001 的消渴降糖膠囊樣品，按供試品制備方法平行制備6 份，分別測定吸光值，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，測定結(jié)果均值(94.35 ±4.29)mg/g，RSD 為4.5%，結(jié)果見表7。

表7 重復(fù)性實驗結(jié)果(n=6)Table 7 Results of Repeated Experiments(n=6)

由表7 可知，測定結(jié)果的RSD 值小于5%，說明此方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率實驗

采用加樣回收率試驗法。稱取已知含量的批號為20091001 的消渴降糖膠囊6 份0.05 g，精密稱定，分別精密量取對照品溶液6 份(100%)，按照供試品溶液制備方法制備并測定其吸光度，計算回收率。結(jié)果見表8。由表8 可知，回收率在95.6% ～104.9%之間，RSD 值小于5%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表8 回收率實驗Table 8 Percentage Recovery Tests

2.9 樣品含量測定

2.9.1 溶劑的選擇 由于黃酮類化合物具有相對較高的親水性，溶于乙醇、甲醇等，同時考慮到甲醇毒性較大［5］，結(jié)合文獻(xiàn)，分別使用水，正丁醇和50%、70%、95%的乙醇按照供試品制備項下操作，進(jìn)行比較預(yù)實驗，考察溶劑的影響，結(jié)果見表9。由表9 可知，50%的乙醇提取效果最佳，因此選用50%的乙醇作為本實驗的提取溶劑。

2.9.2 正交設(shè)計提取樣品中總黃酮含量的方案［6～8］正交設(shè)計提取樣品中總黃酮含量的方案見表10。精密稱取供試品0.1 g，根據(jù)表10 正交設(shè)計安排，分別按照供試品項下操作進(jìn)行超聲處理，之后抽濾，再用95%乙醇定容至10 mL，取0.5 mL按照含量測定項下方法進(jìn)行測定，結(jié)果見表11。

表9 溶劑的選擇Table 9 Solvent Choice

表10 因素水平表Table 10 Level Table of Factors

表11 正交試驗及結(jié)果Table 11 Orthogonal Experiment and Results

2.9.3 最佳配方的確定 由表11 直觀分析K 值可得，提取樣品中總黃酮最佳方案為A2B3C1，即1∶250的料液比75 ℃超聲處理60 min。由R 值可知，在對影響樣品中總黃酮提取的3 個因素中，提取溫度對其影響最大，其次為料液比，影響最小的為提取時間，即C ＞A ＞B。

2.9.4 3 批樣品中總黃酮含量的測定 分別精密稱取3 個批號的待測樣品0.1 g，依據(jù)供試品溶液制備項下的方法制備供試品溶液，按照含量測定項下方法進(jìn)行含量測定，計算含量。結(jié)果見表12。結(jié)果表明:所提供3 批樣品的總黃酮平均含量為87.95 mg/g。

表12 3 批樣品的總黃酮含量Table 12 Content of Total Flavone in Three Batches of Samples

3 結(jié)果

本實驗采用正交設(shè)計法優(yōu)選消渴降糖膠囊中總黃酮的提取工藝，最終確定提取樣品中總黃酮的最佳方案為以1∶250 的料液比，用50%乙醇，75 ℃超聲處理60 min;并用硝酸鋁比色法測定總黃酮的含量，以蘆丁為對照品，亞硝酸鈉、硝酸鋁和氫氧化鈉的用量分別為400 μL、400 μL、5 mL，顯色時間20 min，于500 nm波長處測定消渴降糖膠囊提取物總黃酮的吸光度，并計算濃度及含量;在確定含量測定方法的前提下，實驗進(jìn)行了精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率的試驗考察，證明該含量測定方法的準(zhǔn)確可靠性，以及提取樣品的穩(wěn)定性，并測得消渴降糖膠囊中總黃酮的含量不得少于74.76 mg/g。

4 討論

在提取溶液的選擇上，分別使用正丁醇、水和不同濃度的乙醇在相同條件下超聲提取供試品，結(jié)果表明50%的乙醇溶解情況最好，因此選用50%乙醇。

在確定了溶劑的基礎(chǔ)上，以料液比、提取溫度、超聲提取時間進(jìn)行3 ×3 正交試驗。結(jié)果顯示，1∶250、75 ℃超聲處理60 min效果最好。

實驗中曾考慮不同的提取方法，如加熱回流法、索氏提取器法和超聲提取法等方法，3 種方法均可滿足供試品的提取要求。但超聲提取法更便捷、供試品用量少、省時、節(jié)能，故采用超聲提取法。

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