許強(qiáng)，尹彤

華法林是臨床上最為廣泛使用的抗凝口服藥物，其藥代動(dòng)力學(xué)較為特殊，其穩(wěn)定劑量常常受到飲食、疾病狀態(tài)、共用藥物及基因因素的影響，其中目前較為公認(rèn)的兩個(gè)基因是細(xì)胞色素P450 2C9（CYP2C9）和維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合物1（VKORC1）。國(guó)際多項(xiàng)研究亦根據(jù)上述兩個(gè)基因的變化提出了華法林的藥物基因組學(xué)預(yù)測(cè)公式[1-3]。近年來，也有研究也發(fā)現(xiàn)另一個(gè)基因位點(diǎn)CYP4F2（rs2108622）對(duì)華法林劑量存在相對(duì)較弱影響[4]。目前關(guān)于上述三個(gè)基因位點(diǎn)多態(tài)性（SNP）對(duì)我國(guó)人群低強(qiáng)度抗凝治療的影響程度，及與其他影響華法林劑量的臨床因素之間的相互作用，尚缺乏相應(yīng)的研究。本研究通過對(duì)解放軍總醫(yī)院門診就診的初始采用華法林抗凝治療的患者進(jìn)行SNP檢測(cè)，初步探討SNP對(duì)中國(guó)人群華法林低強(qiáng)度抗凝治療穩(wěn)定劑量的影響價(jià)值[5]。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 納入2011年1月～2012年1月就診于解放軍總醫(yī)院因各種原因擬行低強(qiáng)度華法林抗凝治療的患者，事先告知患者研究方案并取得患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡＜18歲、治療前半年內(nèi)存在嚴(yán)重出血事件、有嚴(yán)重肝腎疾病、擬抗凝治療時(shí)間短于3個(gè)月及入組后進(jìn)行華法林抗凝治療在90天觀察期內(nèi)仍不確定穩(wěn)定劑量。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案及檢測(cè)指標(biāo) 本研究為前瞻性觀察研究。具體方案為：患者晨起空腹抽血測(cè)定國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）以及SNP并開始服用華法林（3mg qd），至服藥后第4天晨起再次抽血檢測(cè)INR，此后由解放軍總醫(yī)院抗凝治療門診臨床醫(yī)師自主決定華法林的調(diào)整方案和INR的檢測(cè)頻率，記錄患者華法林治療的穩(wěn)定劑量，監(jiān)測(cè)患者抗凝治療直至90天。研究期間，指導(dǎo)抗凝治療的臨床醫(yī)師以及患者本人完全不知曉SNP測(cè)定結(jié)果，知曉基因檢測(cè)結(jié)果的實(shí)驗(yàn)研究者對(duì)患者的抗凝過程不知情。

1.3 基因測(cè)序 按照文獻(xiàn)所述方法[6]，抽提患者外周血白細(xì)胞的基因組DNA，經(jīng)PCR對(duì)CYP2C9 外顯子7, VKORC1啟動(dòng)子, 和CYP4F2 外顯子 11片段進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)ABI 3730 自動(dòng)測(cè)序分析儀（Applied Biosystems，USA）進(jìn)行測(cè)序，以檢測(cè) CYP2C9*3（rs 1057910），VKORC1 -1639 G/A（rs9923231）及CYP4F2 V433M（rs2108622）的基因多態(tài)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均值比較采用t檢驗(yàn)或方差分析，組間計(jì)數(shù)資料比較采用χ2分析，采用多元逐步線性回歸分析篩選對(duì)華法林穩(wěn)定劑量存在獨(dú)立影響作用的各項(xiàng)因素；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者的一般情況及基因多態(tài)性分布 共170名患者完成了90天的抗凝治療并達(dá)到華法林穩(wěn)定劑量。平均年齡（59.3±15.5）歲；男性92例（54.1%）；平均穩(wěn)定日劑量（2.81±1.10）mg，患者一般情況和基因多態(tài)性分布情況（表1）。

2.2 基因多態(tài)性對(duì)華法林穩(wěn)定劑量的影響 對(duì)1 7 0 名患者根據(jù)其S N P 進(jìn)行分組，比較每組的華法林穩(wěn)定日劑量差異，結(jié)果顯示，CYP2C9*3 （rs1057910）, VKORC1 -1639 G/A（rs9923231）及CYP4F2 V433M（rs2108622）的SNP均對(duì)患者華法林穩(wěn)定日劑量均有顯著影響（P＜0.05～0.01，表2）。

2.3 低強(qiáng)度抗凝治療華法林穩(wěn)定日劑量的獨(dú)立影響因素分析 采用多元逐步線性回歸分析判斷各項(xiàng)臨床及SNP中對(duì)華法林穩(wěn)定日劑量的影響價(jià)值（表3）。結(jié)果顯示，各項(xiàng)臨床因素中，僅有年齡、體表面積和INR值是影響華法林穩(wěn)定劑量的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其中INR值對(duì)華法林穩(wěn)定劑量的影響貢獻(xiàn)最大（約20.4%）；基因多態(tài)性因素中，CYP2C9*3（rs 1057910）, VKORC1 -1639 G/A （rs9923231）和CYP4F2 V433M（rs2108622）的基因多態(tài)性均對(duì)患者華法林穩(wěn)定日劑量有獨(dú)立且顯著的影響；上述三個(gè)基因的多態(tài)性解釋了18.6%的華法林穩(wěn)定日劑量差異。

表1 患者的臨床一般情況

表2 基因多態(tài)性對(duì)患者華法林穩(wěn)定日劑量的影響

表3 低強(qiáng)度抗凝治療華法林穩(wěn)定日劑量的獨(dú)立影響因素

3 討論

研究證實(shí)，亞洲人群相對(duì)于歐美人群來說，對(duì)華法林的治療反應(yīng)更為敏感，其安全治療窗更窄；多項(xiàng)在亞洲人群華法林抗凝治療并發(fā)癥的研究證實(shí)，在INR值控制于1.8～2.5之間時(shí)，患者的血栓及出血事件發(fā)生率最低[7,8]。因此，低強(qiáng)度抗凝是我國(guó)臨床實(shí)踐中常采納的一項(xiàng)抗凝策略[9]。臨床及基因因素對(duì)低強(qiáng)度抗凝治療起始階段的影響目前仍缺乏進(jìn)一步的研究。

華法林的主要藥理學(xué)作用是通過其S型異構(gòu)體發(fā)揮的，而CYP2C9基因編碼的酶對(duì)S-華法林的代謝具有顯著的影響；VKORC1基因以及CYP4F2 基因的變異對(duì)于S-華法林的作用底物維生素K的代謝具有顯著影響。既往針對(duì)上述三個(gè)基因位點(diǎn)的研究均是在標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)度抗凝（INR：2～3）的臨床策略下進(jìn)行的[10,11]。本研究發(fā)現(xiàn)，與標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)度抗凝治療相似，低強(qiáng)度抗凝情況下，CYP2C9*3（rs 1057910），VKORC1 -1639 G/A（rs9923231），和CYP4F2 V433M（rs2108622）的基因多態(tài)性均顯著影響患者所需的華法林穩(wěn)定日劑量，提示即使進(jìn)行低強(qiáng)度抗凝，了解患者上述基因型變異情況對(duì)及早預(yù)測(cè)患者穩(wěn)定劑量、改進(jìn)抗凝治療反應(yīng)仍存在一定的指導(dǎo)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，年齡、體表面積以及治療后的INR值均是患者華法林劑量的獨(dú)立影響因素，其中治療后的INR值作為患者對(duì)華法林治療的早期反應(yīng)指標(biāo)，對(duì)患者華法林穩(wěn)定劑量差異的貢獻(xiàn)程度最大，這顯示早期測(cè)定患者INR反應(yīng)對(duì)抗凝治療的重要意義，即使明確了患者的年齡、體表面積、基因類型，也不能代替早期測(cè)定INR對(duì)患者華法林劑量調(diào)整的重要作用。但是即使引入了華法林治療的早期INR指標(biāo)，上述基因多態(tài)性指標(biāo)仍然獨(dú)立貢獻(xiàn)了患者華法林穩(wěn)定劑量差異的18.6%。本研究證實(shí)即使獲得了患者治療后的INR指標(biāo)，基因多態(tài)性指標(biāo)仍可輔助臨床醫(yī)師進(jìn)一步精確預(yù)測(cè)低強(qiáng)度抗凝條件下患者的華法林穩(wěn)定日劑量。

由于納入患者數(shù)量較少，本研究并未進(jìn)一步建立華法林劑量的預(yù)測(cè)公式。本研究結(jié)果顯示，在目標(biāo)強(qiáng)度為INR1.8～2.5的低強(qiáng)度華法林抗凝治療中，CYP2C9（rs1057910）、VKORC1（rs9923231）、CYP4F2 （rs2108622）多態(tài)性對(duì)穩(wěn)定劑量存在顯著且獨(dú)立于臨床及INR指標(biāo)的影響，可在臨床工作中對(duì)上述三個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，相應(yīng)調(diào)整華法令劑量，改進(jìn)抗凝初期的治療效果。

[1] Sconce EA,Khan TI,Wynne HA,et al. The impact of CYP2C9 and VKORC1 genetic polymorphism and patient characteristics upon warfarin dose requirements:proposal for a new dosing regimen[J]. Blood,2005,106(7):2329-33.

[2] Takahashi H,Wilkinson GR,Nutescu EA,et al. Different contributions of polymorphisms in VKORC1 and CYP2C9 to intra- and inter-population differences in maintenance dose of warfarin in Japanese, Caucasians and African-Americans[J]. Pharmacogenet Genomics,2006,16(2):101-10.

[3] Kimura R,Miyashita K,Kokubo Y,et al. Genotypes of vitamin K epoxide reductase, gamma- glutamylcarboxylase, and cytochrome P450 2C9 as determinants of daily warfarin dose in Japanese patients[J]. Thromb Res,2007,120(2):181-6.

[4] Wells PS,Majeed H,Kassem S,et al. A regression model to predict warfarin dose from clinical variables and polymorphisms in CYP2C9, CYP4F2,and VKORC1:Derivation in a sample with predominantly a history of venous thromboembolism[J]. Thromb Res,2010,125(6):e259-64.

[5] 唐偉良,彭放,王興祥. 阿司匹林、氯吡格雷和華法令三聯(lián)抗栓方案在冠心病治療中的應(yīng)用[J].中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志,2012,20(10):956-60.

[6] Yin T,Maekawa K,Kamide K,et al. Genetic variations of CYP2C9 in 724 Japanese individuals and their impact on the antihypertensive effects of losartan[J]. Hypertens Res,2008,31(8):1549-57.

[7] You JH,Chan FW,Wong RS,et al. Is INR between 2.0 and 3.0 the optimal level for Chinese patients on warfarin therapy for moderateintensity anticoagulation[J]? Br J Clin Pharmacol,2005,59(5):582-7.

[8] Suzuki S,Yamashita T,Kato T,et al. Incidence of major bleeding complication of warfarin therapy in Japanese patients with atrial fibrillation[J]. Circ J,2007,71(5):761-5.

[9] 吳惠珍,張翠改,李剛,等. 住院患者華法林用藥情況分析[J]. 中國(guó)醫(yī)藥,2012,7(6):739-40.

[10] 朱君榮,魏萌,朱余兵,等. CYP4F2、CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性對(duì)中國(guó)漢族非瓣膜性房顫患者使用華法林劑量的影響[J]. 中國(guó)藥房,2012,23(44):4161-4.

[11] Agustinus Wijaya,蔣廷波,何軍,等. 應(yīng)用VKORC1和CYP2C9基因多態(tài)性準(zhǔn)確評(píng)估患者使用華法林的劑量[J]. 中國(guó)心臟起搏與心電生理雜志,2012,26(3):229-31.