韓莎莎，李俊峽

越來越多的研究表明，急性冠狀動脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）的發(fā)生與動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）斑塊的穩(wěn)定性密切相關，斑塊脂質(zhì)中心越大，纖維帽中的炎細胞（主要是巨噬細胞）越多，斑塊越不穩(wěn)定，越容易破裂而導致ACS的發(fā)生[1,2]。超順磁性氧化鐵（superparamagnetic iron oxide，SPIO）作為一種磁共振對比劑，能被血液中的吞噬細胞特異性吞噬而標記吞噬細胞，標記后的吞噬細胞可以游走到炎癥所在部位并聚集，在磁共振掃描時，造成炎癥所在部位的T2弛豫時間縮短，信號減低。因此可采用SPIO增強磁共振顯示AS斑塊內(nèi)的巨噬細胞，實現(xiàn)早期診斷及評估AS斑塊的穩(wěn)定性。隨著SPIO濃度的升高，巨噬細胞的標記率提高，但是高濃度的SPIO對巨噬細胞有毒性作用。本實驗通過不同濃度的SPIO標記小鼠巨噬細胞RAW264.7，通過檢測細胞標記率、細胞存活率、細胞增殖能力、細胞吞噬功能來評價SPIO標記RAW264.7細胞的最適濃度。

1 資料與方法

1.1 細胞與試劑 小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞株購自中國科學院上海細胞生物學研究所；DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶/EDTA混合液為Hyclone產(chǎn)品；胎牛血清（FBS）為Gibcol產(chǎn)品；超順磁性氧化鐵（SHU555）（商品名Resovest）為德國Sehering公司產(chǎn)品，為荷蘭鹿特丹Erasmus大學醫(yī)學中心放射線科張卓立博士后提供；二甲基亞砜（DMSO）為Sigma產(chǎn)品；四唑鹽（MTT）為Biosharp公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱為德國Hereaus公司產(chǎn)品；CA950-2型超凈臺為上海凈化儀器廠生產(chǎn)；倒置相差顯微鏡為Nikon公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培養(yǎng)基，在細胞培養(yǎng)箱37℃，5%CO2、飽和濕度條件下靜置培養(yǎng)，當RAW264.7巨噬細胞生長到80%左右融合時，0.25%胰酶加EDTA混合液消化細胞，5min左右加入FBS終止消化，再加入DMEM培養(yǎng)基8ml左右，吹打細胞，制成細胞懸液，按1:1傳代。

1.2.2 SPIO標記RAW264.7細胞 將RAW264.7細胞制成細胞懸液，以每孔2.5×105cells接種于內(nèi)置蓋玻片的6孔板中，加入2ml含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，依次向各孔中加入含有SPIO的鐵濃度為14 μg/ml、28 μg/ml、56 μg/ml、84 μg/ml的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，另設1未加SPIO的樣品孔作為空白對照。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后進行普魯士藍染色，光學顯微鏡下觀察SPIO在細胞內(nèi)的標記率，每個樣本進行計數(shù)2個視野，每個視野至少100個細胞。再將SPIO濃度擴大10倍（即140 μg/ml、280 μg/ml、560 μg/ml、840 μg/ml）重復上述步驟。

將式(3)、(9)代入式(10)、(11)可得空間光到少模光纖耦合效率隨橫向偏移rb的變化曲線.由于兩模光纖的模場面積較單模光纖大，且支持三個模式的模場傳輸，當聚焦光斑發(fā)生橫向偏移時，兩模光纖的LP11a模和LP11b模也會接收到信號光，少模光纖接收到的光能量要高于單模光纖，能夠獲得更高的耦合效率，因此少模光纖對光斑橫向偏移的容忍度更高.

1.2.5 中性紅吞噬實驗 將RAW264.7細胞以每孔104的相同細胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每一濃度設3個復孔，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，倒掉舊培養(yǎng)基，以含有SPIO的DMEM培養(yǎng)液與細胞共同培養(yǎng)24h，PBS洗滌3次，每孔加入0.7%的中性紅溶液100μl，繼續(xù)培養(yǎng)3h，棄去中性紅，PBS洗滌3次，吸干，加入細胞裂解液（冰醋酸：無水乙醇=1:1）150 μl，4℃過夜，用酶標儀測定490nm處的吸光光度值。

2.2 細胞活性

鬼算盤錢通，年約四十，暗紫色長衫，外罩藏青色馬褂，清瘦，一副大眾面孔，那怕你和他多次見面也不會留下絲毫印象；

(4)缺乏培養(yǎng)新型人才的實踐環(huán)境。新時期新型人才的培養(yǎng)更加重視理論與實踐的結(jié)合，對于實踐環(huán)境的要求也更高。當前，很多高校的理論課程內(nèi)實驗或設計在計算機機房或者實驗室就可以很好地完成。但是，這些實踐環(huán)境不能滿足企業(yè)的要求，需要和企業(yè)進行更為緊密的合作。

1.2.3 細胞活性檢測 臺盼藍試驗：消化收集常規(guī)培養(yǎng)的未標記及含有SPIO的RAW264.7細胞懸液，并稀釋至106個/ml，取9滴細胞懸液移入小試管內(nèi)，加入1滴0.4%的臺盼藍，混勻，3分鐘內(nèi)在光鏡下計數(shù)100個細胞，其中死細胞染成淡藍色，而活細胞拒染，計數(shù)藍染細胞數(shù)量。活細胞率=（100-藍染細胞/100）×100%的公式計算活細胞百分率，重復測量3次。

選取2018年1—10月在我院接受治療的60例急性單純性闌尾炎患者作為研究對象，按照隨機數(shù)字表法分為兩組，每組各30例。觀察組中，男17例，女13例；年齡12～79歲，平均年齡（34.86±3.92）歲；病程1～10 h，平均病程（4.06±1.33）h。對照組中，男16例，女14例；年齡19～75歲，平均年齡（35.08±3.14）歲；病程1～10 h，平均病程（4.12±1.27）h。兩組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

2 結(jié)果

2.1 普魯士藍染色結(jié)果 普魯士藍染色證實RAW264.7細胞漿內(nèi)有多少不等的藍染鐵顆粒，大部分的鐵聚合物包繞在細胞核周圍，而細胞核內(nèi)或細胞外則未檢測到（圖1）。SPIO的鐵濃度為84μg時，標記24小時細胞的標記率達到100%（圖1b），以后隨SPIO濃度的增加細胞內(nèi)鐵含量增加，普魯士藍染色的顏色越來越深（圖1c～圖1f），而普魯士藍染色的色澤是由吞噬進入細胞內(nèi)鐵的含量所決定的。到280μg/ml時，細胞吞噬鐵含量接近飽和，以后隨SPIO濃度增加，細胞內(nèi)鐵含量沒有增加，普魯士藍染色未見加深。

1.2.4 細胞增殖能力檢測 四唑鹽（MTT）比色實驗：將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞以每孔103的相同細胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每一時相每一組別設3個復孔，24h后更換培養(yǎng)液，以含有SPIO的DMEM培養(yǎng)液與細胞共同培養(yǎng)24h，PBS沖洗，每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去上清液，每孔加入150μlDMSO，振蕩10min，選擇490nm波長在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔的吸光度值（OD）。此后7天每天監(jiān)測并記錄細胞OD值，觀察細胞對不同標記濃度的反應。

術后疼痛程度評分比較,觀察組VAS評分結(jié)果(3.05±1.00)分,與對照組評分結(jié)果(5.50±1.50)分,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2.1 臺盼藍染色結(jié)果 臺盼藍排斥試驗發(fā)現(xiàn)死細胞被染成藍色而活細胞拒染（圖2），提示SPIO濃度對細胞活性有影響，進一步行SNK多重比較檢驗示SPIO濃度為560μg /ml和840μg /ml的兩組與其他組之間有統(tǒng)計學差異（P＜0.05，表1）。

2.2.2 四唑鹽（MTT）比色實驗結(jié)果 根據(jù)MTT比色實驗所得OD值繪制細胞生長曲線（圖3），當SPIO含鐵濃度大于等于280μg /ml時細胞增殖受影響，與對照組及SPIO含鐵濃度小于280μg/ml各組生長曲線相比差異較大，而對照組生長曲線與SPIO含鐵濃度小于280μg /ml各組生長曲線相比未見明顯差異。說明SPIO含鐵濃度大于140μg/ml時抑制RAW264.7細胞增殖。

2.3 中性紅吞噬實驗結(jié)果 細胞核周圍及細胞質(zhì)內(nèi)可見巨噬細胞吞噬的中性紅顆粒（圖4a），將中性紅吞噬實驗所得OD值繪成折線圖（圖4b），可見SPIO含鐵濃度小于等于280μg /ml時，SPIO濃度與OD值成正比，當SPIO濃度超過280μg/ml后OD值與SPIO濃度呈反比，說明SPIO含鐵濃度＞280μg/ml時，巨噬細胞的吞噬功能受到影響。

3 討論

圖1 普魯士藍染色結(jié)果 （SPIO的鐵濃度依次為：1a：28μg /ml，1b：84μg，1c：140μg /ml，1d：280μg /ml，1e：560μg /ml，1f：840μg /ml）

表1 不同SPIO濃度下活細胞數(shù)

圖2 細胞活性檢測（臺盼藍染色，箭頭所指處為藍染死細胞）

圖3 MTT法檢測不同SPIO濃度標記RAW264.7細胞的生長曲線

全球范圍內(nèi)心血管疾病的發(fā)病率逐年升高，其中動脈粥樣硬化及其并發(fā)癥是導致死亡的主要原因。穩(wěn)定性的動脈粥樣硬化主要以血管腔狹窄而造成的各種缺血癥狀為主，而易損斑塊則由于斑塊破裂、血栓形成而產(chǎn)生如心肌梗死、腦血管梗死等急性事件。目前認為動脈粥樣硬化是機體對血管內(nèi)皮損傷所做出的一系列慢性炎癥反應，其中巨噬細胞貫穿于動脈粥樣硬化發(fā)生及發(fā)展的全過程，與斑塊的穩(wěn)定性密切相關[3-5]。

圖4 吞噬功能檢測（4a：中性紅吞噬實驗結(jié)果，4b：細胞吞噬實驗OD值曲線）

馬占龍[5]等的研究證實動脈粥樣硬化斑塊中，巨噬細胞吞噬SPIO使大量納米鐵顆粒在斑塊局部聚集，進而引起了MRI信號的改變，從而可實現(xiàn)粥樣斑塊活體檢測。Raynal等[6]實驗表明，SPIO可通過巨噬細胞的“清道夫”受體（scavenger recep tors SR2A）被吞噬，而很少被內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞攝取[7-9]。這些研究提示通過巨噬細胞吞噬SPIO在磁共振下顯影可實現(xiàn)在體無創(chuàng)檢測及監(jiān)測富含巨噬細胞的易損斑塊的病變發(fā)展，指導臨床治療及預防工作。但需要尋找合適的SPIO濃度，SPIO濃度過高會對細胞產(chǎn)生毒性作用影響細胞功能及活性，SPIO過低則不能清晰顯影粥樣硬化斑塊。本實驗主要通過不同濃度SPIO體外標記RAW264.7小鼠巨噬細胞對巨噬細胞活性和標記率的影響評估了體外標記巨噬細胞的最適濃度。發(fā)現(xiàn)SPIO含鐵濃度84μg/ml即可達到巨噬細胞100%標記，140μg/ml以下不影響細胞增殖，280μg/ml以下不影響細胞吞噬功能。對日后進一步體內(nèi)及體外研究SPIO對巨噬細胞結(jié)構及功能的影響奠定了基礎。

但是，本研究僅從細胞活性和吞噬能力兩方面評價了不同濃度SPIO對RAW264.7細胞的影響，沒有對標記的細胞進行磁共振顯影，無法比較不同濃度SPIO標記的RAW264.7細胞在磁共振下顯影的效果，也沒有通過電子顯微鏡觀察對細胞超微結(jié)構的影響，仍需后續(xù)進一步研究。

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