陳仲燦,牟和平,郭金彪,張綺瓊,劉為民,林樹茂*

(1.佛山市南海區(qū)桂城街道農(nóng)林服務(wù)中心,廣東佛山 528251;2.成都天邦生物科技股份有限公司 ,四川 成都 610100;3.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)系 ,廣東 佛山 528000)

生長(zhǎng)激素受體(Growth Hormone Receptor,GHR)基因的突變是引起性連鎖矮小雞(Sex-linked Dwarf Chicken,SLD)的主要原因,其突變方式包括點(diǎn)突變、結(jié)構(gòu)基因突變、GHR調(diào)控區(qū)突變以及缺失突變等,而且不同突變類型所導(dǎo)致的性連鎖矮小型雞在生產(chǎn)性能上可能表現(xiàn)出較大的差異[1-5]。通過RFLP分析,發(fā)現(xiàn)正常雞GHR基因的一個(gè)6.0 kb條帶在矮小雞僅為 4.3 kb,認(rèn)為這一出現(xiàn)于外顯子 10和 3′UTR區(qū)的 1.7 kb缺失是導(dǎo)致矮小雞的原因[1]。

在優(yōu)質(zhì)肉雞育種中,隱性白羽雞發(fā)揮了重要作用。實(shí)際上,該品種是是從白洛克(或白溫多得)中選育出來的一種快大白羽肉雞中的某些品系。在長(zhǎng)期的育種實(shí)踐中,在隱性白羽雞的基礎(chǔ)上,培育了一個(gè)攜帶GHR缺失突變的矮小型隱性白羽雞。研究表明,GHR基因的缺失突變會(huì)引起肌纖維數(shù)量減少和肌纖維直徑變小,使矮小雞骨骼及生長(zhǎng)發(fā)育受阻[6]。

肌內(nèi)脂肪(intramuscular fat,IM F)是沉積在肌肉塊之內(nèi)的脂肪,分布于肌外膜、肌束膜以及肌內(nèi)膜上。當(dāng)肌束和肌纖維間沉積一定脂肪時(shí),構(gòu)成肉品的大理石紋狀,它不僅提高肌肉的感觀滿意程度,而且增強(qiáng)肉的風(fēng)味、嫩度以及多汁性[7]。對(duì)哺乳動(dòng)物多能干細(xì)胞系的研究表明,脂肪細(xì)胞來源于間充質(zhì)干細(xì)胞[8-10],它們經(jīng)過多次的細(xì)胞代謝分化為前脂肪細(xì)胞、不成熟脂肪細(xì)胞,最終形成成熟脂肪細(xì)胞。

為了進(jìn)一步研究GHR缺失突變對(duì)肌肉組織學(xué)特性和肌內(nèi)脂肪(IM F)沉積的影響,以GHR缺失突變導(dǎo)致的生長(zhǎng)發(fā)育受阻的矮小型隱性白羽雞為研究對(duì)象,以正常型雞為參照,對(duì)其7周齡的肌肉組織學(xué)特性和肌內(nèi)脂肪含量進(jìn)行了測(cè)定,旨在為雞的育種實(shí)踐提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)所用的2個(gè)品種均為隱性白羽洛克雞。其中1個(gè)以隱性白羽洛克雞為基礎(chǔ),通過導(dǎo)入矮小型基因(dw)并經(jīng)多個(gè)世代的選育,形成了遺傳性能穩(wěn)定的矮小型隱性白羽洛克雞,簡(jiǎn)稱矮小型雞;另 1個(gè)為體型正常的隱性白羽洛克雞,簡(jiǎn)稱正常型雞。遺傳分析表明,矮小型雞屬于GHR基因外顯子10末端和3’UT R的1.73 kb大片段缺失突變,未發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)的剪切位點(diǎn)突變;正常型雞則未發(fā)現(xiàn)GHR基因存在突變。

1.2 飼養(yǎng)過程與方法

在進(jìn)小雞的前一周對(duì)雞舍的地面和墻壁、料槽、飲水器進(jìn)行全面的清洗、消毒后,再用高錳酸鉀和福爾馬林對(duì)雞舍進(jìn)行密閉熏蒸消毒(每 m3空間用 20 g高錳酸鉀、40 m L福爾馬林),并準(zhǔn)備好保溫?zé)?墊料,照明器材等育雛設(shè)備。育雛室采用紅外線燈泡保溫,第1周保持32～ 35°C,次后每周降 2°C,直至脫溫。采用室內(nèi)籠養(yǎng)與自由采食相結(jié)合的飼養(yǎng)方法,飼養(yǎng)期為84 d。每天早、中、晚飼喂3次,每次把喂料量記錄下來同時(shí)也把死亡的個(gè)體數(shù)及時(shí)記錄下來。每周四早上進(jìn)行空腹稱重并記錄下來。試驗(yàn)所用飼料的營養(yǎng)水平見表1。

表1 不同階段肉雞的營養(yǎng)水平

1.3 樣本的采集

隨機(jī)抽取按常規(guī)飼養(yǎng)方法飼養(yǎng)至 7周齡的矮小型雞和正常型雞母雞各9只,分離其腿部肌肉。

1.4 肌內(nèi)脂肪含量的測(cè)定

采用索氏抽提法測(cè)定肌內(nèi)脂肪含量,參考《肉與肉制品游離脂肪含量的測(cè)定》(國標(biāo) GB/T-6434-2006),使用乙醚抽提單塊肌肉待測(cè)樣脂肪。每個(gè)樣品測(cè)定3次,以平均值作為樣品的肌內(nèi)脂肪含量。根據(jù)公式 IM F=(提前總重-提后總重)/提前樣品干物質(zhì)總重×100%,計(jì)算干物質(zhì)中 IM F的含量。

1.5 肌肉組織學(xué)特性的測(cè)定

試驗(yàn)雞放血后,立刻取腓腸肌放入冰凍切片機(jī)冷凍(-21°C)30 min后切片,切片厚度為 16μm,每個(gè)樣品做 3張切片,然后將切片進(jìn)行常規(guī) HE染色。每個(gè)樣品的 3張切片中,在 10×20倍視野下,隨機(jī)選取 5個(gè)視野,Nikon E4500數(shù)碼相機(jī)拍照,然后通過江蘇捷達(dá)科技形態(tài)學(xué)分析軟件,分別計(jì)數(shù)肌纖維橫切面的長(zhǎng)軸長(zhǎng)度、短軸長(zhǎng)度、肌纖維根數(shù)、肌纖維間距、肌大束間距。再由長(zhǎng)軸長(zhǎng)、短軸長(zhǎng)的幾何平均數(shù)得到肌纖維直徑;由肌纖維根數(shù)、視野面積兩者相除得到肌纖維密度。

2 結(jié)果

2.1 矮小型雞與正常型雞IMF含量的測(cè)量結(jié)果

肌內(nèi)脂肪 (IMF)含量,矮小型雞平均 14.28%,正常型雞 11.85%。矮小型雞極顯著大于正常型雞(P＜0.01),表明矮小型雞肌內(nèi)脂肪沉積能力比正常型雞更強(qiáng),如表2所示。表2中,數(shù)字右上角字母不同為差異極顯著(P＜0.01),字母相同為差異不顯著(P＞ 0.05),表3同。

表2 兩個(gè)品種雞腿肌中肌內(nèi)脂肪(IM F)含量 %

2.2 矮小型雞與正常型雞肌纖維組織學(xué)特性的測(cè)量結(jié)果

經(jīng)測(cè)量,肌纖維直徑,正常型雞平均 59.28μ m,矮小型雞平均 49.07μ m,矮小型雞極顯著小于正常型雞(P＜0.01);肌纖維密度,正常型雞平均318根 /mm2,矮小型雞平均421根 /mm2,矮小型雞顯著高于正常型雞(P＜0.01);肌纖維間距和肌大束間距,正常型雞平均分別為 5.96μ m和 11.64μ m,矮小型雞平均分別為 5.78μm和 11.85μ m,兩者差異不顯著(P＞ 0.05),如表3所示。

表3 兩個(gè)品種雞肌纖維組織學(xué)特性

圖 1和圖 2為兩個(gè)品種雞的骨骼肌冰凍切片 HE染色的結(jié)果。

圖1 正常型雞骨骼肌冰凍切片(HE染色 200×)

圖2 矮小型雞骨骼肌冰凍切片(HE染色 200×)

3 討論

3.1 GHR缺失突變使隱性白羽雞肌內(nèi)脂肪沉積能力增強(qiáng)

從研究結(jié)果來看,GHR缺失突變所引起的矮小型隱性白羽雞的 IMF含量極顯著高于正常型雞,表明矮小型雞的肌內(nèi)脂肪沉積能力增強(qiáng)。關(guān)于矮小基因?qū)е聞?dòng)物體內(nèi)脂肪含量升高,以往有許多類似的報(bào)道。早在 1971年,GUILLAUME[11]在對(duì)雞dw基因的作用進(jìn)行綜述時(shí)就曾提到矮小雞比正常雞具有更高的脂肪含量。 TOUCHBURN[12]等研究了性連鎖矮小基因(dw)對(duì)5周齡矮小型雞屠體脂質(zhì)積累的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)矮小型雞的屠體脂肪含量比非矮小型雞明顯增加,認(rèn)為脂質(zhì)沉積量的增加是由于脂肪合成增加和能量消耗減少引起的。BURGHELLE-MAYEUR[13]等證實(shí)矮小雞由于脂肪組織的脂肪分解能力下降,使得脂肪含量增加。 SANGIAO-ALVARELLOS[14]等指出,GH缺乏癥(GHD)患者和GHR缺乏的小鼠由于脂肪分配和脂肪動(dòng)員的變化引起脂肪比例增加。大部分肉用畜禽都具有通過增加脂肪組織,而不是增加蛋白組織來表達(dá)增重的潛力。近年來,多數(shù)研究結(jié)果表明,肉雞胴體脂肪含量過多是由于對(duì)增重和生長(zhǎng)速度的選擇所致,用小白鼠進(jìn)行的許多研究,也支持這種結(jié)論[15-17]。此外,改善大白鼠和小白鼠飼料轉(zhuǎn)化率的選擇會(huì)增加胴體脂肪。因此,這些研究的總的結(jié)論是體重、生長(zhǎng)速度和飼料轉(zhuǎn)化率的遺傳改進(jìn)都會(huì)導(dǎo)致胴體脂肪過多[18]。

3.2 GHR缺失突變對(duì)隱性白羽雞肌肉組織學(xué)特性和肌肉品質(zhì)的影響

研究結(jié)果顯示,GHR缺失突變所引起的矮小型雞的肌纖維密度顯著高于正常型雞,與之相對(duì)應(yīng),矮小型雞肌纖維直徑極顯著低于正常型雞。一般情況下,肌纖維密度與肌纖維直徑呈負(fù)相關(guān),肌纖維直徑越小,單位面積所含肌纖維越多,肌纖維密度越大。

另外,影響肌纖維粗細(xì)的因素還包括年齡、品種、營養(yǎng)狀況和運(yùn)動(dòng)量等。年齡越大,肌纖維越粗;地方品種的肌纖維直徑較改良品種的肌纖維直徑細(xì);營養(yǎng)水平低時(shí),肌纖維直徑較小;日增重越快,肌纖維直徑增粗較快。

許多研究表明,肌纖維越細(xì),肉質(zhì)越嫩;肌纖維越粗,肉質(zhì)越差,肌纖維直徑與肉品的柔嫩度密切相關(guān)。孫竹瓏[19]對(duì)藏山羊的組織學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn),藏山羊肌纖維直徑小,肉質(zhì)細(xì)嫩,品質(zhì)良好;肌纖維越細(xì)、密度越大的品種,其肌內(nèi)脂肪的沉積量要多于肌纖維粗而密度低的品種。也就是說,肌纖維直徑越小,密度越大,則肌內(nèi)脂肪越多,肉質(zhì)越好。黃濤[20]曾以感官指標(biāo)與肌肉組織學(xué)指標(biāo)相結(jié)合的方法評(píng)定雞肉品質(zhì),其中感官指標(biāo)是以專業(yè)食品評(píng)價(jià)員進(jìn)行評(píng)定,最終結(jié)果為肌纖維密度越大,脂肪含量越高,雞肉品質(zhì)越好。

研究表明,骨骼肌肌纖維越細(xì),肌束內(nèi)肌纖維越密,肉質(zhì)也越嫩。動(dòng)物出生后肌肉體積的增加主要是由于已經(jīng)存在的肌纖維體積的增大,隨著肌纖維的增粗,肌肉間結(jié)締組織與脂肪組織的增加,肌纖維密度下降。吳信生等[21]對(duì)我國7種地方雞種的組織學(xué)研究表明,肌纖維密度與肌肉的嫩度相關(guān)比較密切,7個(gè)雞種均表現(xiàn)為肌纖維密度越大,肉質(zhì)越細(xì)嫩,7個(gè)地方雞種肌纖維密度與嫩度呈負(fù)相關(guān),肌纖維直徑與嫩度呈正相關(guān),即肌纖維愈細(xì),肌纖維密度愈大,肉質(zhì)越鮮嫩。王亞鳴等[22]研究發(fā)現(xiàn),骨骼肌纖維越細(xì),肌纖維密度越大,肌肉脂肪含量高,則肉質(zhì)細(xì)嫩、味美多汁。矮小型雞的肌纖維間距、肌大束間距與正常型雞差異不顯著。由于肌肉內(nèi)的脂肪組織主要分布在肌束和肌纖維之間,肌內(nèi)脂肪的沉積使肉表現(xiàn)出大理石紋,肌大束間距較大,這有利于沉積脂肪,使肌內(nèi)脂含量達(dá)到理想水平,從而提高肉的風(fēng)味[6]。

4 小結(jié)

GHR基因缺失突變所引起的矮小型隱性白羽雞,肌內(nèi)脂肪沉積能力高于正常型雞,肌纖維直徑極顯著降低,肌纖維密度極顯著升高,表明矮小型隱性白羽雞的肌肉組織學(xué)特性和脂肪沉積能力發(fā)生重大變化。GHR缺失突變所引起的上述變化對(duì)改善隱性白羽雞的肌肉品質(zhì)有利。

[1] AGARWAL S K,COGBURN L A,BURNSIDE J.Dysfunctional growth hormone receptor in a strain of sex-li nked dwarf chicken:evidence for a mutation in the intracellular domain[J].J Endocrinol,1994,142(3):427-434.

[2] HUANG N,COGBURN L A,AGARWAL S K,et al.Overexpression of a truncated growth hormone receptor in the sex-linked dwarf chicken:evidence for a splice mutation[J].M ol Endocrinol,1993,7(11):1391-1398.

[3] TAN AKA M,HAYASHIDA Y,W AKITA M,et al.Expression of aberrantly spliced growth hormone receptor mRN A in the sex-linked dwarf chicken,Gifu 20[J].Growth Regul,1995,5(4):218-223.

[4] ROSEN FELD R G,ROSENBLOOM A L,GUEV ARA-Aguirre J.Growth hormone(GH)insensitivity due to primary GH receptor deficiency[J].Endocr Rev,1994,15(3):369-390.

[5] 肖璐 ,李寧,戴茹娟 ,等.性連鎖矮小雞(dwdw)生長(zhǎng)激素受體(cGHR)基因突變的精確定位 [J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),1996,4(2):174-178.

[7] NO RBERT H,HAUN ERLAND S,FRIEDRICH S.Fatty acid-binding proteins-insights from genetic manipulations[J].Prog Lipid Res,2004,43(4):328-349.

[8] TON G Q,HOT AMISLIGIL G S.Molecular mechanisms of adipocyte differentiation[J].Rev Endocr Metab Disord,2001,2(4):349-355.

[9] ROSEN E D,M ACDOUGALD O A.Adipocyte differentiation from the inside out[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2006,7(12):885-896.

[10] FARMER S R.Transcriptional control of adipocyte formation[J].Cell Metab,2006,4(4):263-273.

[11] GUILLAUME J.Some nutritional and physiological traits of the dw chick[J].Worlds Poult Sci J,1971,27(3):284-285.

[12] TOUCHBURN S P,GUILLAUME J,LECLERCQ B,et al.Lipid and energy metabolism in chicks affected by dwarfism(dw)and Naked-neck(Na)[J].Poult Sci,1980,59(10):2189-2197.

[13] BURGHELLE-M AYEU R C,TIXIER-BOICHARD M,M ERAT P,et al.De novo lipogenesis and lipolysis activities in normal(Dw)and dwarf(dw)White Leghorn laying hens[J].Comp Biochem Physiol B,1989,93(4):773-779.

[14] SANGIAO-ALV ARELLOS S,VZQUEZ M J,VARELA L,NOGUEIRAS R,et al.Central ghrelin regulates peripheral lipid metabolism in a growth hormone-independent fashion[J].Endocrinology,2009,150(10):4562-4574.

[15] 陳繼蘭,文杰 ,趙桂蘋,等.雞肉肌苷酸和肌內(nèi)脂肪等肉品風(fēng)味性狀遺傳參數(shù)的估計(jì)[J].遺傳,2005,27(6):898-902.

[16] 黃秀清,黃建斌,翁志鏗,等.5種不同類型地方雞種肉用性能及肉質(zhì)的研究 [J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) ,2000(1):35-39.

[17] 李文娟,李宏賓,文杰,等.雞 H-FABP和 A-FABP基因表達(dá)與肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)研究 [J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2006,5(7):417-423.

[18] 張海艷,于太永,關(guān)偉軍.肌苷酸形成機(jī)理及其含量影響因素淺析 [J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào),2004,6(3):17-21.

[19] 孫竹瓏.藏山羊肌肉組織學(xué)特性研究[J].西南民族學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,1991,17(3):48-54.

[20] 黃濤,劉華貴,徐淑芳,等.相同營養(yǎng)條件下五種雞肉肌苷酸及其相關(guān)代謝物含量的比較研究[J].飼料工業(yè),2005,26(10):45-47.

[21] 吳信生,陳國宏,陳寬維,等.中國部分地方雞種肌肉組織學(xué)特點(diǎn)及其肉品質(zhì)的比較研究 [J].江蘇農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),1998,19(4):52-58.

[22] 王亞鳴,劉龍芳.江西玉山豬肌肉組織學(xué)特征與肉質(zhì)的關(guān)系 [J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1994,16(3):284-287.