別春雨 姜 濤 蔣曉云 章世元

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009)

農(nóng)作物秸稈是人類從事作物栽培生產(chǎn)過程中大量產(chǎn)生的一類含有一定數(shù)量木質(zhì)素的纖維類可再生資源。據(jù)統(tǒng)計(jì)，1998年我國(guó)秸稈總產(chǎn)量為7.9億 t［1］。通過對(duì)秸稈中木質(zhì)素的降解，提高農(nóng)作物秸稈的飼用率，對(duì)畜禽養(yǎng)殖中飼料資源的開發(fā)具有重要意義。秸稈中的木質(zhì)素和植物細(xì)胞壁中的纖維素、半纖維素緊密結(jié)合在一起，使纖維素降解酶不易與纖維素分子接觸，限制了各種來源的消化酶對(duì)植物體成分的消化［2］。白腐菌能夠分泌胞外木質(zhì)素過氧化物酶(lignin peroxidase，LiP)、錳過氧化物酶(manganese-dependent peroxidase，MnP)、漆酶(laccase)［3－4］，具有降解木質(zhì)素的特性，且被認(rèn)為是目前主要的木質(zhì)素降解微生物［5－6］。而不同地區(qū)的氣候類型、植被種類和土壤成分等因素都會(huì)影響到土壤中微生物的種類、數(shù)量、群系結(jié)構(gòu)和產(chǎn)酶性能。為此，本文旨在通過探討不同取樣點(diǎn)土壤中的真菌密度及木質(zhì)素降解菌的生長(zhǎng)特性，探討植被類型、土壤成分對(duì)木質(zhì)素降解菌生長(zhǎng)特性的影響，擬為后續(xù)從土壤中篩選高效木質(zhì)素降解菌提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)綜合培養(yǎng)基:PDA 37 g、KH2PO43.0 g、MgSO4·H2O 1.5 g、尿素0.01 g、維生素 B1微量，初始 pH 7.0，加蒸餾水至1 000 mL［7］。

選擇培養(yǎng)基:愈創(chuàng)木酚 1.0 g、尿素 0.02 g、酒石酸 0.05 g、蛋白胨 2.6 g、KH2PO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、Na2HPO40.2 g、瓊脂 18 g，初始 pH 7.0，加蒸餾水至 1 000 mL［8］。

PDA-RB亮藍(lán)培養(yǎng)基(過氧化酶鑒定培養(yǎng)基):將RB亮藍(lán)單獨(dú)滅菌后按625μg/mL的濃度加入到PDA培養(yǎng)基中。

PDA-Bavendamm培養(yǎng)基(漆酶鑒定培養(yǎng)基):在PDA培養(yǎng)基中加入鞣酸至終濃度為0.001 g/L。

1.2 土壤主要成分測(cè)定

在揚(yáng)州大學(xué)文匯路校區(qū)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地、南京師范大學(xué)仙林校區(qū)、臨沂市蘭山區(qū)、濰坊市、連云港市選定5個(gè)采樣點(diǎn)，采集枯枝敗葉下10 cm左右的深層土壤，每個(gè)取樣點(diǎn)取10份土樣，共50份土壤樣品。測(cè)定土壤中的總有機(jī)碳(total organic carbon，TOC)和氮、磷、鉀等主要成分的含量。土壤中TOC含量的測(cè)定采用K2Cr2O7-H2SO4氧化法，總磷含量的測(cè)定采用分光光度計(jì)法，總氮含量的測(cè)定采用凱氏定氮法，全鉀含量的測(cè)定則采用火焰光度計(jì)法。

1.3 菌落總數(shù)測(cè)定及菌株初選

在取得的土壤樣品中各取1 g土壤，分別用無菌水按倍比稀釋的方法稀釋為10－1～10－1010個(gè)濃度梯度的土壤懸浮液。結(jié)合涂布法在PDA綜合培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，觀察并記錄每個(gè)平板培養(yǎng)基上的菌落總數(shù)。然后將前面培養(yǎng)所得的菌落接種到選擇培養(yǎng)基上，同時(shí)通過不斷挑取單個(gè)菌株劃線分離直至獲得多個(gè)純菌株，觀察并測(cè)量記錄各個(gè)菌株在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d時(shí)的菌絲直徑(d1)、棕色變色圈直徑(d2)，計(jì)算兩者比值(d1/d2)。

1.4 菌株復(fù)選及生長(zhǎng)量測(cè)定

菌株生長(zhǎng)量的高低一般用其在PDA固體培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)速度來表示，而菌絲生長(zhǎng)速度的測(cè)定常采用菌落直徑測(cè)定法［9］。

將初選菌株變色圈外圍形成的菌絲接種于PDA-Bavendamm平板上，在溫度30℃、濕度80%條件下培養(yǎng)。觀察并記錄產(chǎn)生變色圈的情況及時(shí)間，如果能夠產(chǎn)生棕褐色變色圈則為陽(yáng)性(+)，反之則為陰性(－)［10］。選擇變色圈直徑大的顯色快的菌株接種到PDA-RB亮藍(lán)培養(yǎng)基上進(jìn)一步選擇，在溫度30℃、濕度80%條件下培養(yǎng)5 d。觀察并記錄產(chǎn)生橙黃色變色圈的直徑及時(shí)間。通過上述2個(gè)變色反應(yīng)可篩選出具有產(chǎn)生木質(zhì)素降解酶的優(yōu)勢(shì)菌株，并可對(duì)不同取樣點(diǎn)優(yōu)勢(shì)菌株的產(chǎn)酶特性進(jìn)行比較。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel建立數(shù)據(jù)庫(kù)，采用SPSS 18.0軟件中的單因素方差分析法(one-way ANOVA，LSD)進(jìn)行分析，并進(jìn)行數(shù)據(jù)間的相關(guān)性分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同取樣點(diǎn)土壤成分及真菌密度

2.1.1 土壤成分

由表1可見，5個(gè)取樣點(diǎn)土壤的TOC、總氮、總磷和全鉀含量差異較大。連云港取樣點(diǎn)土壤的TOC、總氮和全鉀含量最高。其中TOC含量比揚(yáng)州取樣點(diǎn)高3.09%(P ＜0.05)，比南京、臨沂和濰坊這 3個(gè)取樣點(diǎn)分別高 191.90%、86.57%和77.63%(P＜0.01)。南京取樣點(diǎn)土壤的 TOC含量最低，極顯著低于其他取樣點(diǎn)(P＜0.01)。連云港取樣點(diǎn)土壤總氮含量分別比揚(yáng)州、南京、臨沂和濰坊取樣點(diǎn)高 51.72%、225.93%、266.67% 和64.49%(P＜0.01)，臨沂取樣點(diǎn)土壤總氮含量最低，揚(yáng)州與濰坊及南京與臨沂取樣點(diǎn)土壤總氮含量間差異不顯著(P＞0.05)。揚(yáng)州取樣點(diǎn)土壤總磷含量最高，分別比南京、臨沂、濰坊和連云港取樣點(diǎn)高 144.44%、52.78% 、69.23% 和 103.70%(P＜0.01)，南京取樣點(diǎn)土壤總磷含量最低。連云港、濰坊和南京3個(gè)取樣點(diǎn)土壤全鉀含量相近(P＞0.05)，并極顯著高于臨沂和揚(yáng)州2個(gè)取樣點(diǎn)(P＜0.01)。各取樣點(diǎn)土壤成分間的相關(guān)性分析結(jié)果表明，土壤中TOC含量與總氮(r=0.84，P＜0.01)、總磷(r=0.52，P ＜ 0.05)的含量相關(guān)關(guān)系顯著。

2.1.2 真菌及木質(zhì)素降解菌密度比較

由表2可知，揚(yáng)州取樣點(diǎn)土壤中真菌和木質(zhì)素降解菌的密度均極顯著大于其他各取樣點(diǎn)(P＜0.01)。臨沂取樣點(diǎn)土壤中的真菌密度居中，連云港、濰坊、南京3地土壤中的真菌密度較低，且這3地間無顯著差異(P＞0.05);而另外4地土壤中木質(zhì)素降解菌的密度則較低。對(duì)各指標(biāo)間的相關(guān)性分析表明，土壤中TOC含量分別與真菌(r=0.52)、木質(zhì)素降解菌(r=0.57)密度有顯著正相關(guān)(P ＜0.05)，總磷含量與真菌(r=0.88)、木質(zhì)素降解菌(r=0.85)密度呈顯著的強(qiáng)正相關(guān)(P＜0.01)，真菌密度與木質(zhì)素降解菌的密度呈顯著的正相關(guān)(r=0.64，P ＜0.05)。

表1 各個(gè)取樣點(diǎn)土壤主要成分的比較Table 1 The comparison of soil main components in each sampling point mg/g

表2 不同地區(qū)土壤中真菌及木質(zhì)素降解菌密度的比較Table 2 The comparison of fungi and lignin-degradating bacteria densities in soil of different areas

2.2 各地優(yōu)勢(shì)菌株的比較

2.2.1 菌株初選

(2)此工件左側(cè)有階梯和槽，在中間還有M24的螺紋，故左側(cè)不方便裝夾，須先加工右側(cè)，再調(diào)頭裝夾右側(cè)，加工左側(cè)。

利用選擇培養(yǎng)基初步挑選出10個(gè)菌株培養(yǎng)6 d后的菌絲直徑(d1)和變色圈直徑(d2)的測(cè)定及d1/d2計(jì)算結(jié)果見表3?？梢钥闯觯x菌株的d1/d2均小于1。部分菌株在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)與變色圈的出現(xiàn)情形如圖1(表及圖中的編號(hào)為:Y——揚(yáng)州，N——南京，L——臨沂，W——濰坊，G——連云港)。

表3 初選10株菌株培養(yǎng)6 d后菌株菌絲直徑(d1)與變色圈直徑(d2)比值Table 3 The ratio of colony diameter(d1)and discoloration circle diameter(d2)of 10 strains after 6 days of culture

圖1 部分菌株選擇培養(yǎng)基上棕色變色圈Fig.1 Part of the bacterial strains produce brown discoloration circles in selection medium

2.2.2 菌株復(fù)選及各優(yōu)勢(shì)菌株產(chǎn)酶特性比較

將初選所得的10個(gè)菌株接種到PDA-Bavendamm培養(yǎng)基和PDA-RB亮藍(lán)培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)選，并對(duì)各地區(qū)取樣點(diǎn)土壤中優(yōu)勢(shì)菌的生長(zhǎng)特性比較。在顯微鏡下觀察，所有被選菌株的菌落均呈類似菊花狀，其菌絲體為白色絮狀，菌體為圓形絨毛狀，菌落呈現(xiàn)乳白色且均勻，扁平，有同生圓。據(jù)此菌落形態(tài)，利用《真菌鑒定手冊(cè)》可初步鑒定本試驗(yàn)所選木質(zhì)素降解菌為白腐真菌屬。

對(duì)被選5個(gè)優(yōu)勢(shì)菌株產(chǎn)酶特性的定性比較結(jié)果見表4?？梢钥闯鯨1、Y1、G1在接種PDA-Bavendamm培養(yǎng)基后第1天即產(chǎn)生變色圈，其中Y1變色圈的表現(xiàn)最為迅速明顯，而W1和N1接種后第2天才開始產(chǎn)生變色圈。培養(yǎng)5 d后，菌株L1、Y1、W1所產(chǎn)生的變色圈幾乎布滿整個(gè)PDA-Bavendamm平板，其中Y1在培養(yǎng)4 d后產(chǎn)生的變色圈幾乎布滿整個(gè)平板(圖2)，而G1和N1培養(yǎng)后第5天產(chǎn)生的變色圈相對(duì)較小。

表4 優(yōu)勢(shì)菌株在PDA-Bavendamm平板顯色反應(yīng)Table 4 Discoloration reaction of advantage strains in PDA-Bavendamm medium

圖2 部分菌株P(guān)DA-Bavendamm平板黃褐色變色圈Fig.2 Part of the bacterial strains produce tan color circles in PDA-Bavendamm medium

5株優(yōu)勢(shì)菌株接種后1～5 d的觀察結(jié)果見表5。5株菌株接種后第1天均產(chǎn)生脫色圈，但脫色圈直徑無顯著差異(P＞0.05)，而到接種后第2天菌株N1脫色圈直徑明顯增大，分別比Y1、L1、W1和 G1 直徑大 136.14%、123.27%、134.52% 和131.19%(P＜0.05)。接種后第3天菌株 N1仍保持較高的優(yōu)勢(shì)(圖3)。但到接種后第5天菌株Y1和W1產(chǎn)生的脫色圈直徑則表現(xiàn)為大于菌株N1、L1 和 G1，但差異不顯著(P ＞0.05)。

表5 優(yōu)勢(shì)菌株在PDA-RB亮藍(lán)平板上脫色圈直徑Table 5 The decolorizing circle diameter of advantage strains in PDA-RB bright blue plate cm

圖3 部分菌株P(guān)DA-RB亮藍(lán)平板上淺褐色脫色圈Fig.3 Part of the bacterial strains produce shallow brown decolorizing circles in PDA-RB medium

2.2.3 菌株生長(zhǎng)速度

通過測(cè)量菌落在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的直徑確定不同菌株的生長(zhǎng)速度，試驗(yàn)結(jié)果如表6，通過初選和復(fù)選最終得到的5株優(yōu)勢(shì)菌株在溫度30℃、濕度80%條件下基礎(chǔ)培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d。接種后第2天菌株L1、N1和G1生長(zhǎng)速度顯著高于Y1和W1(P＜0.05)，接種后第5天菌落直徑最大的是W1，為7.92 cm，幾乎長(zhǎng)滿整個(gè)平板，分別比 Y1、N1、L1 和 G1 大 2.99%、9.03%、5.74% 和14.29%，G1菌落生長(zhǎng)速度最慢。

表6 菌株生長(zhǎng)速度比較Table 6 The comparison of bacterial strain growth rates cm

3 討論

據(jù)研究，土壤中微生物的數(shù)量及其群系結(jié)構(gòu)受土壤有機(jī)組成、總氮、總磷、全鉀和土壤生態(tài)環(huán)境(如植被)等的影響較大［11］。在本試驗(yàn)的5個(gè)采樣地區(qū)中，南京取樣點(diǎn)土壤中真菌和木質(zhì)素降解菌密度均較低，而揚(yáng)州取樣點(diǎn)中的真菌和木質(zhì)素降解菌密度均極顯著高于其他取樣點(diǎn)，分析原因可能是南京取樣點(diǎn)的土壤采于灌木叢，并沒有高大的植被覆蓋，紫外線具有強(qiáng)烈的殺菌作用且能部分透過低矮的灌木叢，故其土壤中真菌受紫外線影響較大。揚(yáng)州取樣點(diǎn)的土壤植被為常綠針葉林，對(duì)紫外線有良好的遮擋作用，從而減少了紫外線對(duì)土壤真菌的殺滅作用。土壤中真菌密度還受到土壤類型的影響，其中揚(yáng)州地區(qū)褐土中真菌密度極顯著高于另外4地。此外本試驗(yàn)中不同采樣點(diǎn)土壤中的TOC含量與木質(zhì)素降解菌的密度呈正相關(guān)(r=0.57，P ＜0.05)，說明木質(zhì)素降解菌的密度還受到土壤中TOC含量的影響。

生長(zhǎng)速度較快的菌株能在短時(shí)間內(nèi)獲得大量菌絲體生物量，而大量的菌絲體生物量是產(chǎn)酶的物質(zhì)基礎(chǔ)［12］。因此，選擇一定時(shí)間內(nèi)生物量高的菌株是篩選高效菌株的重要措施之一。本試驗(yàn)以菌落生長(zhǎng)直徑代表菌絲體生物量，選擇在PDA培養(yǎng)基中菌落生長(zhǎng)直徑大的菌株作為復(fù)選的后備菌株。經(jīng)過復(fù)選每個(gè)地區(qū)最終各選留了1株生長(zhǎng)量高的菌株作為下一步產(chǎn)酶特性研究的對(duì)象，并取得了較理想的效果。這一結(jié)果表明在菌株篩選的初期，用菌落生長(zhǎng)直徑的大小來代表菌絲體生物量是可行的。

由于木質(zhì)素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，目前人們常利用具有木質(zhì)素類似結(jié)構(gòu)的一類化合物，如愈創(chuàng)木酚、單聚物香草酸、苯酚、磷甲基苯酚;二聚物愈創(chuàng)木基甘油－B－松柏醇醚(GGE)、1，2－二愈創(chuàng)木基丙烷－1，3－二醇、脫氫聯(lián)松柏醇(DCA)等其中的任意1種，作為唯一碳源制作成選擇培養(yǎng)基來篩選木質(zhì)素降解菌［13］。Nishida 等［14］認(rèn)為，能在以愈創(chuàng)木酚等為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基上產(chǎn)生變色圈的微生物表明其具有降解木質(zhì)素的能力。本試驗(yàn)利用愈創(chuàng)木酚為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基，從土壤中篩選出了具有木質(zhì)素降解能力的菌株。進(jìn)一步的研究表明:真菌在以前述化合物制作的選擇培養(yǎng)基上產(chǎn)生的變色圈有2類:一類是在菌絲圈外圍形成棕色變色圈，菌絲圈與變色圈的比值小于1;另一類則是在菌絲圈以內(nèi)形成變色圈，菌絲圈與變色圈比值大于 1［15］。Rodrguez 等［16］的試驗(yàn)表明，菌絲圈直徑與變色圈直徑的比值可作為判斷該菌是否能優(yōu)先選擇性地降解木質(zhì)素的依據(jù):比值小于1的真菌能首先選擇性降解木質(zhì)素，而比值大于1的真菌則優(yōu)先選擇降解纖維素。本試驗(yàn)選擇菌絲圈直徑與變色圈直徑比值小于1的10個(gè)菌株經(jīng)進(jìn)一步純化后作為后續(xù)復(fù)選的研究對(duì)象。

研究表明白腐真菌對(duì)木質(zhì)素的降解是通過幾種酶共同作用的結(jié)果，其中起主要作用的有漆酶和過氧化物酶［17］。真菌分泌的漆酶能夠使鞣酸等酚類化合物聚合，其反應(yīng)特征是可在含有酚類化合物的漆酶鑒定培養(yǎng)基上形成棕褐色變色圈，并可根據(jù)變色圈的呈現(xiàn)時(shí)間及大小來定性地鑒定白腐真菌產(chǎn)生漆酶與降解木質(zhì)素的能力［18］。而具有木質(zhì)素降解能力的真菌所產(chǎn)生的過氧化物酶能夠使RB亮藍(lán)脫色，據(jù)其在PDA-RB亮藍(lán)培養(yǎng)基上出現(xiàn)淡黃色脫色圈的時(shí)間和直徑大小可定性地檢測(cè)各個(gè)菌株產(chǎn)生過氧化酶的能力。經(jīng)定性鑒定的結(jié)果表明，本試驗(yàn)篩選得到的木質(zhì)素降解菌株均具有明顯產(chǎn)生漆酶和過氧化物酶的特性，而且來自于不同地區(qū)取樣點(diǎn)土壤中的優(yōu)勢(shì)菌株木質(zhì)素降解酶產(chǎn)生的速度與持續(xù)時(shí)間差異明顯。揚(yáng)州取樣點(diǎn)土壤中木質(zhì)素降解優(yōu)勢(shì)菌產(chǎn)生漆酶的速度較快，臨沂、揚(yáng)州和連云港取樣點(diǎn)土壤中優(yōu)勢(shì)菌產(chǎn)生漆酶的能力較強(qiáng)。南京取樣點(diǎn)土壤中木質(zhì)素降解優(yōu)勢(shì)菌產(chǎn)生過氧化酶的速度較快，揚(yáng)州和濰坊取樣點(diǎn)土壤中優(yōu)勢(shì)菌產(chǎn)生過氧化物酶的能力較強(qiáng)。這些均為后續(xù)進(jìn)一步研究木質(zhì)素降解菌對(duì)秸稈的降解及飼料原料的開發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

①不同地區(qū)土壤中木質(zhì)素降解菌的種群結(jié)構(gòu)差異較大。在有機(jī)物含量高、常綠植被覆蓋率高的褐土地區(qū)采集土壤有助于獲得理想的高效木質(zhì)素降解優(yōu)勢(shì)菌株。

②本試驗(yàn)篩選獲得的菌株均能夠產(chǎn)生漆酶和木質(zhì)素過氧化酶等木質(zhì)素降解酶。

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