楊 艷 瞿明仁 歐陽(yáng)克蕙 趙向輝 易中華 宋小珍

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南昌 330045;2.江西省畜牧技術(shù)推廣站，南昌 330077)

近年來(lái)，由于動(dòng)物生長(zhǎng)性能和集約化程度的不斷提高，現(xiàn)代反芻動(dòng)物生產(chǎn)中開(kāi)始大量使用高比例精料的飼糧，以提高牛、羊生產(chǎn)水平和生產(chǎn)效率，但是，這往往導(dǎo)致動(dòng)物采食量下降、瘤胃菌群失調(diào)、瘤胃酸中毒等。乳酸是瘤胃碳水化合物代謝過(guò)程中的一種中間產(chǎn)物，瘤胃內(nèi)乳酸濃度的高低是瘤胃功能正常與否的一個(gè)重要指標(biāo)。反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)乳酸濃度顯著升高是導(dǎo)致急性瘤胃酸中毒、瘤胃炎、肝水腫等代謝疾病的直接原因?；技毙粤鑫杆嶂卸镜牟⌒罂捎^察到瘤胃乳酸濃度由小于5 mmol/L 急劇上升到 50 ～120 mmol/L［1］，嚴(yán)重酸中毒時(shí)甚至超過(guò)300 mmol/L［2］。煙酸是動(dòng)物必需營(yíng)養(yǎng)素之一，是生物細(xì)胞氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的合成前體。一般情況下，反芻動(dòng)物攝入與瘤胃合成的煙酸量足夠滿(mǎn)足其營(yíng)養(yǎng)需要，一般不需要額外補(bǔ)充。但隨著“高精料短周期”肥育模式的推廣，反芻動(dòng)物對(duì)煙酸等B族維生素的需求也越來(lái)越大［3－4］。NAD+是細(xì)胞生物化學(xué)過(guò)程中重要的輔因子，對(duì)生物體內(nèi)多種生物代謝起重要的調(diào)控作用。那么在高精料飼糧條件下，精料比及煙酸對(duì)錦江黃牛瘤胃酸代謝是否有影響，影響的機(jī)制如何，目前尚不清楚，也鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)對(duì)高精料飼糧條件下，添加煙酸對(duì)瘤胃乳酸及揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)生的影響進(jìn)行研究，旨在探討瘤胃酸中毒新的調(diào)控思路和方法，減少酸中毒所造成的巨大經(jīng)濟(jì)損失，促進(jìn)反芻動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、設(shè)計(jì)及飼糧

選用3頭平均體重為(275±20)kg、安裝有永久性瘤胃瘺管的錦江黃牛，采用精料比例逐步提高來(lái)誘導(dǎo)酸中毒的試驗(yàn)方法。試驗(yàn)分4期，每期10 d，第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期依次飼喂精料比例分別為60%、70%、80%的飼糧，研究不同精料比例對(duì)錦江黃牛瘤胃乳酸及揮發(fā)性脂肪酸濃度的影響;第Ⅳ期研究在精料比例為80%的飼糧條件下，添加煙酸對(duì)瘤胃乳酸及揮發(fā)性脂肪酸濃度的影響。試驗(yàn)動(dòng)物每日飼喂2次(07:00和19:00)，自由飲水。

煙酸購(gòu)于鄭州興禾化工有限公司，食品級(jí)，純度大于98%。煙酸添加量為800 mg/kg(根據(jù)歐陽(yáng)克蕙等［5］研究報(bào)道確定)。試驗(yàn)飼糧參照我國(guó)肉牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 815—2004)［6］設(shè)計(jì)，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets %

1.2 樣品的采集及預(yù)處理

每期最后3 d(13:00)采集樣品。分別在瘤胃高、中、低3點(diǎn)采集瘤胃液各50 mL，每頭牛分別取樣分裝。取1 mL瘤胃液，12 000 r/min離心5 min，去掉上清液，添加 300 μL HCl(0.2 mol/L)，萃取NAD+，破壞掉 NADH，50℃水浴10 min，然后迅速放在冰中冷卻至0℃，接著逐滴添加300 μL NaOH(0.1 mol/L)進(jìn)行中和，1 mL 槍頭反復(fù)吹打混勻，12 000 r/min離心10 min，將上清液移至另一管中待用，－80℃保存用于NAD+濃度的測(cè)定;另取1 mL瘤胃液，12 000 r/min離心5 min，去掉上清液，以300 μL NaOH(0.2 mol/L)萃取 NADH，添加300 μL HCl(0.1 mol/L)進(jìn)行中和，其余步驟同NAD+，－80℃保存用于NADH濃度的測(cè)定［7］。

其余瘤胃液經(jīng)4層消毒紗布過(guò)濾。取100 mL濾液迅速轉(zhuǎn)移至100 mL離心管中，1 500 r/min離心10 min，去除原蟲(chóng)和飼料大顆粒后快速分裝，－80℃保存，以備測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸、乳酸及丙酮酸濃度;另取10 mL濾液，6 mL立即測(cè)定總脫氫酶活性，剩余4 mL濾液4℃冷藏，12 h內(nèi)測(cè)定乳酸脫氫酶活性。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 pH

瘤胃液采集后，充分混合，采用PHS－320型pH計(jì)立即測(cè)定pH。

1.3.2 揮發(fā)性脂肪酸濃度

采用氣相色譜法測(cè)定:杭州科曉GC－1690型氣相色譜儀，氫火焰離子化(FID)檢測(cè)器，OV－1701通用型毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.32 mm×0.5μm)，2000色譜數(shù)據(jù)工作站，內(nèi)標(biāo)物為巴豆酸。采用程序升溫:初溫80℃，初時(shí)3.5 min，升速30℃/min，終溫180℃，終時(shí)10 min;進(jìn)樣室溫度260℃，檢測(cè)器溫度260℃;柱前壓力0.05 MPa，氮?dú)庾鳛檩d氣。樣品進(jìn)樣量1μL。

1.3.3 丙酮酸、乳酸濃度及乳酸脫氫酶活性

采用TU－1810D型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)，試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.4 NAD+、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)濃度

參照李駱冰等［8］的方法。反應(yīng)混合液:0.1 mol/L Bicine buffer(pH 8.0)2 mL、無(wú)水乙醇75 μL、12 mmol/L 噻 唑 藍(lán) (MTT)100 μL、16.6 mmol/L乙硫吩嗪(PES)200 μL 混合，30 ℃水浴10 min。反應(yīng)體系:依次添加50μL樣品、2 mL的反應(yīng)混合液和20μL的乙醇脫氫酶(500 U/mL)，迅速混勻，測(cè)定。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定并得到標(biāo)樣反應(yīng)液在570 nm吸光度(A570nm)隨時(shí)間變化曲線，15 min內(nèi)吸光度變化與時(shí)間成正比。試驗(yàn)中取測(cè)定時(shí)間為7 min。繪制5個(gè)已知濃度標(biāo)樣的A570nm隨時(shí)間變化曲線斜率圖，對(duì)每個(gè)標(biāo)樣試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行線性擬合，得到該標(biāo)準(zhǔn)濃度下A570nm隨時(shí)間變化曲線的斜率。以A570nm隨時(shí)間變化曲線斜率為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為縱坐標(biāo)作圖，得到NAD+(或NADH)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

樣品測(cè)定:將樣品的A570nm隨時(shí)間變化曲線的斜率值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出相應(yīng)的濃度值。

1.3.5 總脫氫酶活性

參照哈茲耶夫［9］的方法。對(duì)照管首先加入5 mL異丙醇，然后在對(duì)照管和樣品管各加入100目尼龍布過(guò)濾的新鮮瘤胃液2 mL及0.2 mL 1.5%的氯化三苯四氮唑(TTC)混勻?；靹蚝罅⒓磳?duì)照管和樣品管放在厭氧條件下恒溫39℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)10 min。樣品管迅速加入5 mL異丙醇終止反應(yīng)。3 min后將對(duì)照管和樣品管的反應(yīng)液以4 000 r/min離心10 min。上清液稀釋15倍，于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在485 nm處比色測(cè)吸光度(A485nm)。將在38.5℃、pH 6.8條件下，每分鐘引起測(cè)定液吸光度上升0.1的酶量定義為1個(gè)酶活單位。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙酸對(duì)瘤胃酸代謝的影響

由表2可知，在試驗(yàn)第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期，未添加煙酸的情況下，隨著精料比例的提高，瘤胃pH顯著下降(P＜0.05);瘤胃中的乙酸、丙酸、丁酸、總揮發(fā)性脂肪酸濃度隨著精料比例的提高而提高，70%、80%精料比例與60%精料比例之間差異顯著(P＜0.05)，但70%和80%精料比例之間差異不顯著(P＞0.05);而瘤胃中的丙酮酸、乳酸濃度及乳酸/丙酮酸也隨著精料比例的提高而提高，60%與70%精料比例之間差異不顯著(P＞0.05)，80%精料比例與60%、70%精料比例之間差異顯著(P ＜0.05)。

在試驗(yàn)第Ⅲ、Ⅳ期，精料比例為80%條件下，與未添加煙酸相比，添加煙酸顯著提高了瘤胃pH及丙酸、總揮發(fā)性脂肪酸濃度(P＜0.05)，顯著降低了丙酮酸、乳酸濃度及乳酸/丙酮酸(P＜0.05)，而乙酸、丁酸濃度及乙酸/丙酸差異不顯著(P＞0.05)。

表2 煙酸對(duì)瘤胃酸代謝的影響Table 2 Effects of nicotinic acid on acid metabolism of rumen

2.2 煙酸對(duì)瘤胃中NAD+(H)濃度及與酸代謝有關(guān)酶活性的影響

由表3可知，在試驗(yàn)第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期，未添加煙酸的情況下，各精料比例對(duì)瘤胃中NAD+濃度無(wú)顯著差異(P＞0.05)，但有隨著精料比例的提高而降低的趨勢(shì);總脫氫酶活性隨著精料比例的提高而顯著降低(P＜0.05)。各精料比例對(duì)瘤胃中NADH濃度、NADH/NAD+無(wú)顯著影響(P＞0.05)，但有隨著精料比例的提高而提高的趨勢(shì)。

在試驗(yàn)第Ⅲ、Ⅳ期，精料比例為80%條件下，與未添加煙酸相比，添加煙酸對(duì)瘤胃中NAD+、NADH濃度、NADH/NAD+、總脫氫酶活性均無(wú)顯著影響(P＞0.05)，但有提高 NAD+濃度，降低NADH濃度及NADH/NAD+的趨勢(shì)。

第Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ期瘤胃中均未檢出乳酸脫氫酶活性，而在試驗(yàn)第Ⅲ期，精料比例為80%(未添加煙酸)條件下，瘤胃中檢出了乳酸脫氫酶，其活性為132.9 U/mL。

3 討論

3.1 精料比例對(duì)瘤胃酸代謝的影響

在試驗(yàn)第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期，未添加煙酸的情況下，隨著精料比例的提高，瘤胃pH顯著下降;瘤胃中的乙酸、丙酸、丁酸、總揮發(fā)性脂肪酸濃度隨著精料比例的提高而提高，70%、80%精料比例與60%精料比例之間差異顯著，但70%和80%精料比例之間差異不顯著。而瘤胃中的乳酸濃度及乳酸/丙酮酸也隨著精料比例的提高而提高，60%與70%精料比例之間差異不顯著，80%精料比例與60%、70%精料比例之間差異顯著。可見(jiàn)，瘤胃pH的顯著下降，主要是由于乳酸大量產(chǎn)生而導(dǎo)致的。同時(shí)，隨著精料比例的提高，60%、70%和80%精料比例使瘤胃中NADH濃度、NADH/NAD+有提高的趨勢(shì)，NAD+濃度有降低的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)殡S著精料比例的提高，飼糧中豐富的淀粉和糖類(lèi)被瘤胃內(nèi)各種微生物所降解，生成葡萄糖、果糖、木糖等己糖和戊糖，然后經(jīng)酵解轉(zhuǎn)化為丙酮酸，同時(shí)大量的 NAD+還原成 NADH，NADH/NAD+升高，促使了瘤胃乳酸產(chǎn)量的增加和乳酸/丙酮酸升高，這也說(shuō)明了乳酸是瘤胃pH顯著下降的主要原因。因此，高精料飼糧對(duì)瘤胃酸代謝具有顯著影響，主要是使乳酸大量產(chǎn)生。如果長(zhǎng)時(shí)間使用高精料飼糧具有酸中毒的危險(xiǎn)。

表3 煙酸對(duì)瘤胃中NAD+(H)濃度及與酸代謝有關(guān)酶活性的影響Table 3 Effects of nicotinic acid on NAD+(H)concentrations and acid metabolism-related enzyme activities in rumen

3.2 煙酸對(duì)瘤胃酸代謝的影響

煙酸是動(dòng)物必需營(yíng)養(yǎng)素之一。一般情況下，反芻動(dòng)物攝入與瘤胃合成的煙酸量足夠滿(mǎn)足其營(yíng)養(yǎng)需要，不需要額外補(bǔ)充。但隨著動(dòng)物生產(chǎn)性能的提高和飼糧結(jié)構(gòu)的改變，對(duì)煙酸等B族維生素的需求也越來(lái)越大。有研究認(rèn)為，煙酸有利于緩解反芻動(dòng)物的高精料應(yīng)激［3－4］。本研究結(jié)果表明，80%精料比例條件下，與未添加煙酸相比，添加煙酸顯著提高瘤胃pH，抑制了因精料比例提高而pH進(jìn)一步下降，使瘤胃pH保持在正常范圍內(nèi)。乳酸的酸度比揮發(fā)性脂肪酸高數(shù)十倍［10］，乳酸濃度升高可導(dǎo)致瘤胃pH迅速降低，本試驗(yàn)條件下，添加煙酸使乳酸濃度、乳酸/丙酮酸顯著降低。因此，添加煙酸具有緩解瘤胃酸應(yīng)激的作用。Brent等［3］報(bào)道，補(bǔ)飼煙酸有益于受到應(yīng)激刺激的公牛，尤其是那些采食高精料飼糧有不良應(yīng)激反應(yīng)的公牛。Byers等［4］總結(jié)了14個(gè)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)肉牛飼糧中添加50～250 mg/kg煙酸可促進(jìn)育肥家畜盡快適應(yīng)育肥期飼糧，顯著提高平均日增重與飼料利用率。Niehoff等［11］研究表明煙酸的使用效果和基礎(chǔ)飼糧中精料比例有關(guān)。當(dāng)基礎(chǔ)飼糧中精料比例為80%時(shí)，添加煙酸才有效。當(dāng)飼糧中粗飼料含量達(dá)到50%時(shí)，添加煙酸效果不佳。這可能與低精料比例飼糧條件下，乳酸產(chǎn)生量小有關(guān)。

3.3 煙酸對(duì)瘤胃NAD+(H)濃度及乳酸脫氫酶活性的影響

煙酸是動(dòng)物體內(nèi)NAD+的直接前體，與碳水化合物代謝和乳酸的產(chǎn)生密切相關(guān)。乳酸脫氫酶是催化生成乳酸的關(guān)鍵酶，瘤胃內(nèi)乳酸脫氫酶的活性反映了瘤胃的乳酸產(chǎn)生能力。NAD+是NADH的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，對(duì)乳酸脫氫酶有抑制作用。本研究結(jié)果表明，當(dāng)未添加煙酸的情況下，由于飼糧精料比例的提高，消耗NAD+，使瘤胃中NAD+濃度下降，NADH濃度提高，而添加煙酸后則相反，NAD+濃度提高，NADH濃度下降。值得注意的是試驗(yàn)第Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ期均未檢出乳酸脫氫酶，原因可能是檢測(cè)方法不夠靈敏，但不代表這3個(gè)試驗(yàn)期瘤胃中沒(méi)有乳酸脫氫酶，而在試驗(yàn)第Ⅲ期，精料比例為80%(未添加煙酸)的條件下，瘤胃中檢出了乳酸脫氫酶，其活性為132.9 U/mL，同時(shí)，其乳酸濃度也是4個(gè)試驗(yàn)期中最大的，為1.184 mmol/L。這可能是在精料比例80%沒(méi)有添加煙酸時(shí)，NAD+濃度下降，降低其對(duì)乳酸脫氫酶的抑制作用，使乳酸脫氫酶活性大幅度升高，達(dá)到了本方法檢測(cè)的靈敏度。本研究結(jié)果與Krause等［12］、Russell等［13］研究結(jié)果相似。

4 結(jié)論

添加煙酸提高了瘤胃 NAD+濃度，降低了NADH濃度及NADH/NAD+，抑制了乳酸脫氫酶活性和乳酸產(chǎn)生，從而緩解瘤胃酸應(yīng)激或酸中毒。

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