張曉佩 高承芳 李文楊 劉 遠(yuǎn) 董曉寧

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 福州 350013）

多花黑麥草（Lolium multiflorum）又名意大利黑麥草、一年生黑麥草，是一年生或者越年生禾本科植物，原產(chǎn)地中海沿岸[1]，是優(yōu)良的牧草和草坪草。作為牧草具有生長(zhǎng)快、產(chǎn)草量高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、適口性好等優(yōu)點(diǎn)，適用于飼喂各種畜、禽、魚。它也可以作為先鋒草種和保護(hù)草種用于草坪。近年來(lái)，多花黑麥草在我國(guó)栽培的面積日益擴(kuò)大，尤其是在我國(guó)長(zhǎng)江流域及其以南地區(qū)。

RAPD標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)廣泛用于植物的遺傳多樣性、圖譜構(gòu)建、品種鑒定、基因定位、分子標(biāo)記輔助育種等研究[2-3]。目前RAPD標(biāo)記技術(shù)主要用于多花黑麥草遺傳多樣性和品種資源研究[4-6]。本研究初次進(jìn)行與株高性狀相關(guān)的RAPD標(biāo)記分析，旨在為多花黑麥草育種提供分子學(xué)方面的基本資料。

1 材料與方法

1.1 材料 選用多花黑麥草品種資源4份：美克斯、?？死锼?、劍寶和特高，由百綠公司北京分公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 基因組DNA提取采用改進(jìn)CTAB法[7]，最后測(cè)基因組DNA濃度，并用0.1×TE稀釋到終濃度100 ng/mL。放在-20℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

按照每個(gè)品種取25個(gè)個(gè)體DNA的數(shù)量，經(jīng)過(guò)測(cè)DNA濃度后，稀釋成等濃度后等量混合，制成品種的混合DNA（池DNA），用隨機(jī)引物進(jìn)行擴(kuò)增分析。

1.2.2 株高數(shù)據(jù)記錄 黑麥草的株高數(shù)據(jù)來(lái)自試驗(yàn)田記錄（取群體均值）。株高測(cè)量方法：測(cè)定地面到最高葉片尖端的垂直高度。在出苗后生長(zhǎng)第60 d（即營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期），每個(gè)品種隨機(jī)取20株測(cè)量垂直高度，植株各垂直高度的算術(shù)平均值為測(cè)定植株的高度。1.2.3 RAPD擴(kuò)增及檢測(cè) 從110條隨機(jī)引物中篩選出68條，用該68條隨機(jī)引物分別對(duì)4個(gè)黑麥草品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后篩選出23條多態(tài)性高、重復(fù)性好的隨機(jī)引物（如表1），對(duì)所有的4個(gè)黑麥草品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為 20μL：10×buffer 2.0 μL，MgC122.0 μL，25 mmo1/L dNTP 2.0 μL，TaqDNA聚合酶1 U，引物1μL，總DNA 100 ng和ddH2O 12μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為95℃變性1 min，36℃退火2 min，72℃延伸1.5 min，共46個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上檢測(cè)，電壓120 V，電泳25 min，用BIO-RAD Ge1 Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)記錄拍照。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 同一引物擴(kuò)增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的條帶被認(rèn)為具有同源性，屬于同一位點(diǎn)的產(chǎn)物按擴(kuò)增陽(yáng)性（1）或擴(kuò)增陰性（2）記錄電泳帶譜，利用SASSystem進(jìn)行多態(tài)性標(biāo)記的t檢驗(yàn)，以獲得與株高性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，顯著水準(zhǔn)P＜0.05。多態(tài)頻率用多態(tài)帶數(shù)目與擴(kuò)增出所有主帶的比率表示。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 引物篩選與RAPD擴(kuò)增結(jié)果 最后用于4種多花黑麥草基因組DNA的RAPD擴(kuò)增的23條引物擴(kuò)增結(jié)果重復(fù)率高、擴(kuò)增條帶多態(tài)性好，擴(kuò)增結(jié)果見表1、圖1。不同引物和不同多花黑麥草品種基因組DNA引起擴(kuò)增的條帶數(shù)目不同，數(shù)目變化在4～12個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)的比例為75%～100%?？傊?，從110條中篩選出的23條引物，共擴(kuò)增出174條帶，其中多態(tài)性條帶有166個(gè)，因此，多態(tài)性位點(diǎn)占的比例是95.4%。結(jié)果說(shuō)明，多花黑麥草基因組DNA多態(tài)性非常豐富。

2.2 與株高性狀相關(guān)性分析 把研究群體按照標(biāo)記基因型的種類不同分成兩種類型，即1型和2型，對(duì)不同標(biāo)記基因型的株高性狀進(jìn)行方差分析，得到株高性狀與多個(gè)標(biāo)記之間的相關(guān)值。方差分析結(jié)果表明：在23條引物中有6條特異性標(biāo)記條帶，分布在5條引物中，與多花黑麥草的株高性狀呈現(xiàn)出顯著相關(guān)（P ＜0.05）。從表 2中可以看出：S04-6、S15-3、S50-5、S50-8、S67-2、S99-7 等 6 條特異性標(biāo)記帶與多花黑麥草株高性狀有著顯著的相關(guān)。

表1 引物序列和擴(kuò)增結(jié)果

圖1 部分引物擴(kuò)增結(jié)果

由以上結(jié)果可以看出，研究中用23條引物共擴(kuò)增了166個(gè)特異性條帶，但經(jīng)過(guò)t檢驗(yàn)，與目標(biāo)性狀(株高)相關(guān)的標(biāo)記僅有6個(gè)，說(shuō)明166個(gè)特異性條帶所代表的位點(diǎn)控制著更多的性狀，并不僅限于株高。

表2 RAPD標(biāo)記類型與株高的關(guān)聯(lián)分析

從t檢驗(yàn)結(jié)果可以看出，6個(gè)標(biāo)記中有基因1型大于基因2型的，也有基因2型大于基因1型的，說(shuō)明對(duì)多花黑麥草株高性狀來(lái)講，有3個(gè)標(biāo)記是增效的，有3個(gè)標(biāo)記是減效的。選擇有增效標(biāo)記的個(gè)體留種可以增加選種的準(zhǔn)確性，加快黑麥草育種的進(jìn)程，因此，這些分子標(biāo)記輔助選擇育種對(duì)于黑麥草的育種十分有意義。

3 小結(jié)

1）用基因組DNA作RAPD檢測(cè)多花黑麥草株高性狀位點(diǎn)的方法是可行的，本研究篩選出了23個(gè)隨機(jī)引物對(duì)4個(gè)多花黑麥草品種的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，共得到174條帶，其中166條帶為多態(tài)性條帶，標(biāo)記率為95.4%。

2）用RAPD技術(shù)檢測(cè)出了4個(gè)多花黑麥草品種基因組DNA的6個(gè)株高性狀的標(biāo)記（分布在5條引物中），它們是 S04-6、S15-3、S50-5、S50-8、S67-2、S99-7等。

[1] Ca11ow M,Miche H,et a1.The effect of defo1iation practice in western Ausa1ia on ti11er deve1opment of Annua1 Ryegrass(Lo1ium rigidum)and Ita1ian ryegrass(Lo1ium mu1tif1omm)and its association with forage qua1ity[J].Gass and Frage Science,2000,55:232-241.

[2] 黃艷霞,白昌軍.分子標(biāo)記技術(shù)及在牧草中的應(yīng)用[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,28(4):81-85.

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