方成俊陳俊玉王碧生楊奇志潘迎芬陳 暉陳旭新

（1.東山出入境檢驗檢疫局 福建東山 363401；2.美國Protein Simp1e公司中國廣州辦事處 廣州 510000）

對蝦桃拉綜合征病毒（TSV）于1992年最早出現(xiàn)在南美最大對蝦養(yǎng)殖國家厄瓜多爾，對蝦感染病毒后死亡率高達40%～95%，曾引起美洲對蝦養(yǎng)殖業(yè)的巨大損失，與對蝦白斑綜合征病毒（WSSV）、對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）一起被FAO稱為“影響世界對蝦養(yǎng)殖的三大病害”。對蝦桃拉綜合征病毒基因組為單鏈RNA病毒，暫歸于小RNA病毒科，該病毒主要感染西半球的對蝦品種，如南美白對蝦、凡納對蝦（P.vannamei）、藍腳細對蝦（P.setiferus）等，其中以南美白對蝦最為敏感，因為TSV在其體內(nèi)能迅速增殖并向外釋放。近幾年由于我國成功引進南美白對蝦，大規(guī)模養(yǎng)殖已開始，我國對蝦產(chǎn)量的50%以上都來自于南美白對蝦，如果該病在我國流行并蔓延，將對我國的對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成沉重的打擊。據(jù)報道，對蝦桃拉綜合征已在我國臺灣地區(qū)發(fā)生過大面積暴發(fā)，在廣東、廣西、海南、福建等省沿海海水對蝦養(yǎng)殖密集區(qū)也有發(fā)生。以標記特異性熒光探針為特點的熒光定量PCR技術(shù)（F1uorescence Quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR），如 TaqMan探針、HybProbe雜交探針技術(shù)，集PCR和探針雜交技術(shù)為一體，直接探測PCR過程中的熒光變化，實現(xiàn)DNA模板的準確定量結(jié)果，整個過程實行閉管式實時測定，是目前最先進的PCR技術(shù)。目前國內(nèi)還未有應(yīng)用實時熒光PCR技術(shù)進行桃拉綜合征病毒檢測的研究報道。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 對蝦桃拉綜合征病毒毒株由南海水產(chǎn)研究所提供，其他對照毒株（皮氏桿狀病毒、斑節(jié)對蝦型桿狀病毒、中腸腺壞死桿狀病毒、傳染性皮下造血壞死病毒、肝胰腺細小病毒和呼腸孤病毒）由本單位保存。試驗對蝦采自福建省和廣東省各養(yǎng)殖場。Taq酶和AMV反轉(zhuǎn)錄酶為TaKaRa公司產(chǎn)品。實時熒光定量PCR儀型號為羅氏LightCyc1er1.5。

1.2 方法

1.2.1 樣本RNA的提取 取患蝦肝臟，放于滅過菌的研缽中，加入無菌處理和DEPC處理過的500μL PBS或生理鹽水，進行快速研磨，直至無固體物存在。收集研磨產(chǎn)生的液體移到離心管中6 000 r/min離心20 s，取上清備用。取若干個1.5 mL經(jīng)滅菌的無RNA酶污染的離心管，作好標記。首先各加入600μL Trizo1，然后分別加入相應(yīng)編號的樣本上清液各200μL，吸打混勻，再加入200μL氯仿，振蕩混勻。靜置5 min，12 000 r/min離心10 min。分別吸取各管中的上層液相（切勿吸入下層液體）轉(zhuǎn)移至新的作好相應(yīng)標記的1.5 mL無RNA酶污染的離心管中，加入-20℃預(yù)冷的異丙醇400μL，顛倒混勻，靜置5 min，12 000 r/min離心10 min。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，吸干液體；加入700μL 75%乙醇，顛倒洗滌，12 000 r/min離心5 min；輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量吸干液體。4 000 r/min離心10 s，用微量加樣器盡量將殘余液體吸干，室溫干燥1～5 min。加入15μL DEPC水，輕彈混勻，溶解管壁上RNA，保存于-18℃以下備用。

1.2.2 引物與探針 上游引物：5’-CTAATATTGTCATGTATCCTTGGGTG-3’， 下 游 引 物 ：5’-ATACTGGAGCACGCGTTACTGA-3’，探針：FAM-5’-CCAGCAGATGTTCCTGAGGAGCCC-3’-TAMRA。根據(jù)各引物的分子量以及合成時的OD值，計算每個引物和探針的儲存液濃度，然后用RNase Free水溶解稀釋，分裝后于-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 實時熒光定量PCR反應(yīng)體系與循環(huán)條件實時熒光定量PCR反應(yīng)體系見表1。循環(huán)條件為step1：50 ℃ 30 min，95 ℃ 2 min；step2：95 ℃ 5 s，60℃ 40 s，40個循環(huán)。

表1 Taura病毒熒光PCR反應(yīng)體系的各組分情況

1.2.4 閥值設(shè)定與結(jié)果分析 閥值設(shè)定原則為超過陰性對照擴增曲線（無規(guī)則噪音線）的最高點。Cp值＞45為陰性，Cp值＜45為陽性，Cp值在 44～46的標本需重新測定一次，再按上述要求判定。陽性標本定量數(shù)據(jù)的測定，實時熒光定量PCR儀會根據(jù)各個標準品測得的et值繪制成標準曲線后儀器自動計算陽性樣本的拷貝數(shù)據(jù)并在電腦界面上顯示。

2 結(jié)果與分析

2.1 對蝦桃拉綜合征病毒實時熒光定量PCR的建立 為驗證設(shè)計、合成的引物和探針的性能，分別利用針對Taura病毒所設(shè)計的各套引物探針，進行實時熒光PCR擴增，篩選出能夠工作的引物與探針最佳組合。同時，進行反應(yīng)體系以及PCR反應(yīng)程序的優(yōu)化。

在進行Taura病毒實時熒光PCR反應(yīng)時，需對所用儀器中每個檢測孔設(shè)置相應(yīng)的單熒光信號收集，選擇的熒光檢測通道應(yīng)與探針所標記的熒光報告基團的波長一致，如Taura病毒FAM檢測收集。具體設(shè)置方法因儀器而異，應(yīng)參照儀器使用說明書。

2.2 引物探針組合篩選 通過檢索文獻，確定靶基因，從GeneBank下載所有Taura病毒的序列，用生物軟件進進序列比對，截取最一致的序列進行引物探針設(shè)計，將設(shè)計好的引物探針在GeneBank上進行B1ast比對，驗證引物探針的保守性。隨后進一步試驗篩選出最佳引物和探針組合，以確定為本方法中所使用的引物和探針的兼容性和效率，并進行相關(guān)的優(yōu)化最佳PCR反應(yīng)濃度組、反應(yīng)條件、特異性、靈敏度和適用性測試。選擇的引物探針序列位置分別見圖1，核酸序列見表2。

圖1 對蝦桃拉綜合征病毒引物和探針的設(shè)計

表2 對蝦桃拉綜合征病毒引物探針序列

2.3 體系優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 Taq酶的優(yōu)化 Taq酶用量（以單位U計）從1～5以1單位為梯度遞增。從試驗結(jié)果中可知，不同酶用量對Cp值的影響很小，Taq酶用量分別為1 U、2 U、3 U、4 U和5 U時，陽性模板的Cp值在23.16～23.94的較狹窄范圍內(nèi)波動。但選定4 U Taq酶進行反應(yīng)時，反應(yīng)體系的熒光增量最高。故選擇4 U Taq酶作為本熒光PCR反應(yīng)中使用的Taq酶用量。

2.3.2 Mg2+用量優(yōu)化 將25 mM MgC12加樣量從3～6μL，以1μL為梯度遞增。從多次重復(fù)試驗結(jié)果可知，25 mM MgC12加樣量在3μL以上時對Cp值的影響很小，但在6μL時反應(yīng)體系的熒光增量最高，所以選定25 mM MgC12加樣量為6μL作為本熒光PCR反應(yīng)中單個反應(yīng)的用量。

2.3.3 引物探針用量優(yōu)化 將10 mM的引物加樣量從 0.25～1μL遞增，10 mM的探針加樣量從0.125～0.5μL遞增。將不同濃度的引物和探針配比，用所提取的核酸進行擴增。從多次重復(fù)的試驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn)：不同濃度的引物、探針對于該陽性模板Cp值基本穩(wěn)定在22.18～23.86，但引物濃度為10μM、加樣量為2μL，Taura病毒探針濃度為10μM、加樣量為0.5μL的熒光擴增效率較高，效率在90%～100%。所以，選定2條引物加樣量均為2μL，Taura病毒探針加樣量0.5μL作為熒光PCR反應(yīng)的引物和探針濃度。

2.3.4 循環(huán)條件優(yōu)化結(jié)果 試驗結(jié)果顯示，采用循環(huán)條件一的體系無論是Cp值還是曲線的擴增效率都較循環(huán)條件二的結(jié)果好，故選擇循環(huán)條件一作為熒光PCR擴增時的循環(huán)條件。

循環(huán)條件一為step1：50℃ 30 min，95℃ 2 min；step2：95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，40 cyc1es。循環(huán)條件二為step1：50 ℃ 30 min，95 ℃ 2 min；step2：95 ℃ 5 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，40 cyc1es。

2.4 實時熒光PCR擴增結(jié)果

2.4.1 實時熒光PCR擴增結(jié)果 為檢測Taura病毒設(shè)計的一套引物和探針，其擴增效果很好，出現(xiàn)了特異且典型的檢測曲線，Cp值約為23，擴增效果見圖2。

圖2 Taura病毒樣品模板擴增曲線

2.4.2 靈敏度試驗結(jié)果 取Taura病毒標準毒株，按 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的倍數(shù)梯度稀釋，取最后5個梯度的毒株樣品進行熒光PCR檢測，以確定該方法最低檢出濃度，具體結(jié)果見表3和圖3。本研究建立的熒光PCR方法到10-6稀釋度時還可以檢出，檢出限在450個病毒拷貝左右，比普通PCR方法的10-4檢測限高100倍。

表3 熒光PCR檢測法結(jié)果

圖3 Taura病毒實時熒光PCR檢測結(jié)果

2.4.3 特異性試驗結(jié)果 用Taura病毒的實時熒光PCR體系檢測收集到的所有Taura病毒毒株，以及常見的其他對蝦病毒毒株。特異性試驗結(jié)果如表4和圖4。所有的Taura病毒毒株檢測結(jié)果均為陽性，而非Taura病毒毒株檢測結(jié)果為陰性，熒光PCR檢測結(jié)果的特異性為100%。

2.4.4 檢測時間優(yōu)化結(jié)果 普通PCR檢測試驗共需8個步驟：樣本DNA提取、DNA擴增、瓊脂糖配制、制電泳板、加樣、電泳、結(jié)果報告、擴增片段，約需240 min。實時熒光定量PCR僅需前面2步，通過優(yōu)化循環(huán)條件，檢測時間約45～60 min，約為普通PCR檢測方法的1/4。

3 討論

3.1 引物探針設(shè)計原理 實時熒光PCR的引物與探針設(shè)計應(yīng)該遵循以下原則：（1）選擇病原體RNA不形成高級結(jié)構(gòu)的區(qū)域進行設(shè)計，保持GC含量在30%～80%，引物Tm值為58～60℃，引物對間不能形成二聚體或二聚體的自由能應(yīng)大于-3.5 kc/m，單個引物自身形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的自由能也必須大于-3.5 kc/m。在引物序列中，不能出現(xiàn)連續(xù)的G，而且3’端盡量避免G或C的出現(xiàn)，在引物的最后5個堿基內(nèi)，不應(yīng)有兩個以上的G或C，以便提高引物的特異性。（2）選擇沒有RNA自身二聚體的區(qū)域進行探針設(shè)計，保持GC含量在30%～80%，探針的Tm值為68～70℃，5’端不能是G，探針自身不形成二聚體。另外，上游引物與探針之間距離不能相距太遠。擴增的目的核酸片斷大小應(yīng)在70～150 bp。

表4 Taura病毒熒光PCR檢測特異性試驗

圖4 Taura病毒特異性試驗

Taura病毒的探針引物的設(shè)計，通過下載Gen－Bank中所有Taura病毒的基因組序列，進行比對，找到該病毒的高度保守區(qū)，將該保守區(qū)放入Gen－Bank中進行B1ast比對，找出其與其他物種的同源區(qū)，在設(shè)計引物和探針時避開這些同源區(qū)。這樣設(shè)計出來的引物探針對，再進行B1ast對比，以分析其與其他物種的同源性，以評價其可以造成的錯檢可能。最終的生物信息學(xué)分析顯示，所設(shè)計的引物和探針相對Taura病毒的序列而言高度保守，相對其他非Taura病毒的所有其他物種而言非常特異。因而，通過嚴格的探針設(shè)計原則，熒光PCR檢測方法在理論上切實可行。

3.2 Taura病毒實時熒光PCR的特異性 用Taura病毒實時熒光PCR試劑分別檢測多種對蝦病毒，試驗結(jié)果顯示，Taura病毒毒株檢測結(jié)果為陽性，而非Taura病毒毒株檢測結(jié)果為陰性，說明熒光PCR引物TrPf80、TrPr223和引物TrPb172對Taura病毒毒株的檢測特異性為100%。Taura病毒熒光PCR檢測方法的高度特異性很好地避免了許多方法在檢測過程中出現(xiàn)的錯檢和漏檢現(xiàn)象，因此，具有顯著的優(yōu)越性。

3.3 Taura病毒實時熒光PCR的靈敏度 通過一系列的靈敏度試驗及統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)表明，Taura病毒實時熒光PCR檢測方法的靈敏度均達到了10-6（450個病毒拷貝）的水平，每個反應(yīng)管的檢測靈敏度則達到了百位數(shù)。由于整個反應(yīng)的靈敏度受很多因素影響，如RNA的提取方法、反應(yīng)體系中各成分的濃度、反應(yīng)條件的設(shè)置以及儀器本身的檢測性能等都能顯著影響系統(tǒng)靈敏度。

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