陳 偉，熊 晶，陳 懿，潘文杰，李智勇

(1.貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽 550081;2.貴州省威寧縣煙草分公司，威寧 553100;3.貴州省煙草公司，貴陽 550003)

類胡蘿卜素是影響煙葉品質(zhì)和香氣風(fēng)格的主要成分之一，其相關(guān)降解產(chǎn)物與煙葉的香氣質(zhì)和香氣量密切相關(guān)［1］。煙草葉面分泌物約占鮮葉重的0.5%—10%，是煙草香味和香氣組分的重要前體物［2-3］?？緹燁惡}卜素和表面提取物含量不僅受制于種質(zhì)遺傳組成的影響，而且與生態(tài)條件和栽培措施有著十分密切的聯(lián)系異［4］。對煙葉類胡蘿卜素和表面提取物的研究在國內(nèi)外煙草行業(yè)一直是一個熱點。近年來，科技工作者就綜合生態(tài)因素對烤煙類胡蘿卜素及表面提取物的影響進行了研究［5-10］，但這些研究偏重于不同生態(tài)區(qū)域的本身差異。氣候和土壤是主要的生態(tài)因素，二者的影響程度(貢獻率)不同，有關(guān)氣候和土壤對烤煙類胡蘿卜素及表面提取物的影響強弱，以及哪些是主導(dǎo)影響因子等研究尚未見報道。β-胡蘿卜素和葉黃素是烤后煙葉中類胡蘿卜素的主要成分［11］，烤煙表面提取物主要成分是腺毛分泌物和烷烴類［12-13］。本研究將貴州省不同煙葉典型產(chǎn)區(qū)(生態(tài)條件差異較大)的土壤進行交換，進行本土和異地客土田間小區(qū)試驗，細分氣候與土壤對烤后煙葉類胡蘿卜素及表面提取物含量的影響效應(yīng)，探討關(guān)鍵生態(tài)影響因子，為揭示烤煙香氣風(fēng)格的形成機理奠定理論基礎(chǔ)，進而研究彰顯當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)特色，彌補當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)不足的最佳栽培技術(shù)，為構(gòu)建不同質(zhì)量風(fēng)格特色煙葉生產(chǎn)的核心技術(shù)提供實踐依據(jù)和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 參試地點及其氣候條件

試驗于2009—2010年在貴州開陽、威寧和天柱3縣進行。威寧試地位于 N 27°06'40.8″，E103°48'57.3″，海拔2111m。開陽試地位于 E107°06'40.8″，N26°52'24.8″，海拔1130m。天柱試地位于 N 26°57'25.2'，E 109°15'50.2'，海拔640m。氣象數(shù)據(jù)來源于貴州省氣象局，以3個試驗點所在縣的氣象臺數(shù)據(jù)為準?？緹煷筇锷L前期的氣象要素值統(tǒng)計時段為移栽當(dāng)天至采收第1炕，成熟期的氣象要素值統(tǒng)計時段為第1次采收至采收結(jié)束。試驗點的氣候狀況如表1。

表1 試驗點不同生長期的主要氣象數(shù)據(jù)Table 1 Main meteorological data at different growth stages at three sites

1.2 試驗設(shè)計

2009年開陽設(shè)處理1:天柱土壤，耕作層與犁底層挖出后分層填入(打破犁底層);處理2:威寧土壤，打破犁底層;處理3:開陽土壤，犁底層與下層土壤直接相連(未打破犁底層);處理4:開陽土壤，打破犁底層。天柱和威寧設(shè)處理1:開陽土壤，打破犁底層;處理2:當(dāng)?shù)赝寥溃蚱评绲讓?處理3:當(dāng)?shù)赝寥?，未打破犁底層?010年威寧試點增加天柱土壤(打破犁底層)處理，天柱試點增加威寧土壤(打破犁底層)處理。3次重復(fù)，隨機區(qū)組排列。移栽前分別在開陽、威寧和天柱3個試驗點取供試土壤0—20cm樣品3個送貴州省農(nóng)學(xué)科學(xué)研究院測定土壤理化性。供試土壤基本理化性狀見表2。

表2 供試土壤基本理化性狀Table 2 The basic physiochemical property of tested soils

1.3 供試品種及試驗過程

供試品種為云煙85。各試點選取代表當(dāng)?shù)氐湫蜕鷳B(tài)特性、肥力中等、均勻一致、上一年無種植烤煙和蔬菜歷史、沒有煙草根莖性病害史的地塊。要求光照充分，坡度3°—5°，四周有保護煙地。移栽前15d，試驗地按方案要求開挖深0.4m，寬3.0m，長5.2m的試驗池(小區(qū))，0—20cm耕作層和20—40cm犁底層分開，分別裝袋運往其它試驗點。試驗池間隔0.5m，重復(fù)間溝寬0.8m。試驗池四周用較厚的塑料膜隔開，按處理要求分層填土，池口高于地面。移栽前一周順坡起壟，壟高25cm，壟距1m，壟長5.2m，單一處理共3行且兩側(cè)再起保護壟兩行。當(dāng)?shù)刈罴岩圃云谝圃裕昃?.52m，每小區(qū)種煙30株，畝施純氮6kg。50%煙株達盛花期一次性打頂，有效留葉20片/株。其它田間管理按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉標(biāo)準化生產(chǎn)管理進行。每小區(qū)選擇取20株長勢均勻一致、無病蟲害發(fā)生的煙株，掛牌標(biāo)記下部葉(從下向上第4位葉)、中部葉(第10位)和上部葉(第16位)。分小區(qū)單獨采收標(biāo)記煙葉，獨立綁桿，統(tǒng)一烘烤，烤后煙葉用于類胡蘿卜素和表面提取物含量測定。

1.4 類胡蘿卜素含量測定

稱取約0.5g煙葉樣品，加入90%丙酮-水溶液30mL，超聲萃取30min，過濾，煙葉固體用萃取液洗滌3次，定容至50mL容量瓶中，搖勻，靜置后過0.45μm濾膜轉(zhuǎn)移到色譜瓶中進行液相色譜測定。

Agilent1100色譜儀配備二極管陣列檢測器;色譜柱 Zorbax SB-C18(150×4.6mm，5.0μm，Agilent公司)，柱溫為25℃;流動相A為乙腈;二氯甲烷=4∶1(體積分數(shù));流動相B為水。梯度洗脫條件:0min 0%B;5min 5%B;10min 0%B。流速為1.0mL/min，進樣量為 20.0μL;檢測波長:450nm。β-胡蘿卜素、葉黃素(Fluka公司，Switzerland，純度大于97%);HPLC級的二氯甲烷、乙腈(TEDIA，USA);丙酮為分析純;水為二次亞沸石英蒸餾水。

1.5 表面提取物含量測定

稱取煙葉樣品10 g，先后在裝有200 mL二氯甲烷的3個燒杯中浸洗。在第1只燒杯中浸洗4次，每浸一次在溶劑中停留，待二氯甲烷稍揮發(fā)，再在第2、3只燒杯中重復(fù)浸洗，每次浸洗時葉片倒順序提取(即上次最后提取的葉片首先被浸洗)。3次提取完成后，將含有葉面提取物的溶劑過濾到平底燒瓶內(nèi)(濾紙內(nèi)放無水硫酸鈉50 g)，過濾漏斗、燒杯和濾紙均用二氯甲烷沖3次以上。然后將浸提液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在40℃下濃縮，最后移入琥珀色瓶中，定容至10 mL，置于0℃左右暗處備測。

稱取0.336 g芳樟醇于500 mL容量瓶中用異丙醇定容，轉(zhuǎn)移到試劑瓶中，貼上標(biāo)簽，作為內(nèi)標(biāo)。移取煙葉腺毛分泌物提取濃縮物2 mL，加入1 mL內(nèi)標(biāo)，再濃縮至1 mL，進行GC或GC/MS分析。氣相色譜條件:TRACE GC 氣相色譜儀(Finnigan 公司);色譜柱為 DB-5 30m×0.25mmid×0.25μmdf.;初溫100 ℃，恒溫2 min后以4℃/min升至180℃，保持30 min以8℃/min升至280℃，保持25 min;進樣口250℃，F(xiàn)ID 280℃;He2為載氣，流速為1.5 mL/min;分流流量60 mL/min;進樣量2.0 μL。質(zhì)譜條件:TurboMass色質(zhì)聯(lián)用儀(PE公司);色譜柱為 DB-5 30m×0.25mmid×0.25μmdf.;載氣 He;流速為1.5 mL/min;傳輸線溫度 250 ℃，離子源溫度170℃;EI能量70 eV，掃描范圍35—450 uam，其余色譜條件同GC。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel軟件和DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行統(tǒng)計分析，同時引入偏Eta平方值［14-15］，并轉(zhuǎn)換為百分率，來比較氣候和土壤對烤后煙葉類胡蘿卜素和表面提取物含量變異的貢獻率大小?；疑P(guān)聯(lián)分析按照灰色系統(tǒng)理論［16］進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氣候與土壤條件下種植的烤后煙葉類胡蘿卜素含量差異分析

類胡蘿卜素是煙葉的重要致香前體物，主要由β-胡蘿卜素、葉黃素、新黃質(zhì)和紫黃質(zhì)組成［17］，其中β-胡蘿卜素含量最高，葉黃素次之，紫黃質(zhì)最少［18］。本文研究了不同氣候和土壤對β-胡蘿卜素和葉黃素含量的影響，以為揭示烤煙香氣風(fēng)格的形成機理奠定基礎(chǔ)。

2.1.1 同一土壤在不同氣候下種植的烤后煙葉β-胡蘿卜素和葉黃素含量差異分析

表3為開陽、威寧和天柱3種土壤在不同氣候下種植的烤后煙葉β-胡蘿卜素和葉黃素含量?？梢钥闯觯_陽土壤在本地、威寧和天柱氣候下，β-胡蘿卜素和葉黃素含量均為下部葉＞中部葉＞上部葉;當(dāng)?shù)貧夂蛳路N植的烤后煙葉平均β-胡蘿卜素含量和葉黃素含量與威寧氣候間無統(tǒng)計學(xué)差異，顯著高于天柱氣候，分別為其1.82和2.04倍。威寧土壤在本地、開陽和天柱氣候下，β-胡蘿卜素和葉黃素含量均為下部葉＞上部葉＞中部葉;當(dāng)?shù)貧夂蛳路N植的煙葉平均β-胡蘿卜素含量和葉黃素含量與開陽氣候間差異未達顯著水平，顯著高于天柱氣候，分別為其1.38和1.23倍。天柱土壤在本地、開陽和威寧氣候下，β-胡蘿卜素和葉黃素含量都是上部葉＞下部葉＞中部葉;平均β-胡蘿卜素含量和葉黃素含量3種氣候間差異顯著，當(dāng)?shù)貧夂蜃畹?，開陽氣候最高，開陽氣候下的平均β-胡蘿卜素含量和葉黃素含量分別是天柱的3.0倍和3.88倍。由此可見，同一土壤在不同氣候條件下種植煙葉的β-胡蘿卜素和葉黃素含量存在顯著差異，但其部位特征表現(xiàn)一致。

2.1.2 同一氣候條件下不同土壤種植的烤后煙葉β-胡蘿卜素和葉黃素含量差異分析

由表3可知，開陽氣候條件下，3種植煙土壤烤后煙葉β-胡蘿卜素和葉黃素含量的部位間差異各不相同，威寧土壤下部葉最高，中部葉最低;天柱土壤上部葉最高，中部葉最低;開陽土壤下部葉最高，上部葉最低。從3部位平均值來看，開陽和威寧土壤種植煙葉的β-胡蘿卜素和葉黃素含量無統(tǒng)計學(xué)差異，顯著低于天柱土壤;天柱土所產(chǎn)煙葉的平均β-胡蘿卜素含量分別是開陽土和威寧土的1.48和1.57倍，平均葉黃素含量分別是開陽土和威寧土的1.99和1.85倍。威寧氣候條件下，開陽土壤種植煙葉的β-胡蘿卜素和葉黃素含量為下部葉＞中部葉＞上部葉，威寧土壤為下部葉＞上部葉＞中部葉，天柱土壤為上部葉＞下部葉＞中部葉;平均β-胡蘿卜素含量和葉黃素含量3種土壤間無顯著差異。天柱氣候條件下，開陽土壤種植煙葉的β-胡蘿卜素和葉黃素含量為下部葉＞中部葉＞上部葉，天柱土壤與之相反，威寧土壤為下部葉＞上部葉＞中部葉;平均β-胡蘿卜素含量和葉黃素含量3種土壤間無統(tǒng)計學(xué)差異。上述說明，相同氣候條件下不同土壤種植煙葉的β-胡蘿卜素和葉黃素含量差異不顯著，其部位特征也明顯不同。

表3 不同氣候與土壤條件下種植的烤后煙葉β-胡蘿卜素和葉黃素含量Table 3 The β-carotene and lutein content of cured tobacco leaves from different soils under different climates

2.2 不同氣候與土壤條件下種植的烤后煙葉表面提取物含量差異分析

腺毛分泌物及烷烴類蠟質(zhì)是煙葉表面提取物中的最主要成分。本文分析了不同氣候與土壤對烤后煙葉腺毛分泌物及烷烴類蠟質(zhì)的影響，對了解不同煙區(qū)烤煙香型差異有重要的現(xiàn)實意義。

表4 不同氣候與土壤條件下種植的烤后煙葉腺毛分泌物和烷烴類蠟質(zhì)含量Table 4 The trichome secretions and alkane waxiness content of cured tobacco leaves from different soils under different climates

2.2.1 同一土壤在不同氣候下種植的烤后煙葉腺毛分泌物和烷烴類蠟質(zhì)含量差異分析

表4為開陽、威寧和天柱3種土壤在不同氣候下種植的烤后煙葉腺毛分泌物和烷烴類蠟質(zhì)含量?？梢钥闯觯_陽土壤在本地和天柱氣候下，威寧土壤在開陽和天柱氣候下，天柱土壤在本地和開陽氣候下，烤后煙葉腺毛分泌物含量均隨部位升高而增加，烷烴類蠟質(zhì)含量為上部葉＞下部葉＞中部葉。3種土壤在威寧氣候下烤后煙葉腺毛分泌物和烷烴類蠟質(zhì)含量都表現(xiàn)為中部葉＞上部葉＞下部葉。開陽土壤的烤后煙葉平均腺毛分泌物和烷烴類蠟質(zhì)含量3種氣候間的差異均達顯著水平，當(dāng)?shù)貧夂蚓畹?腺毛分泌物含量天柱氣候最高，烷烴類蠟質(zhì)含量威寧氣候最高，分別為當(dāng)?shù)貧夂虻?.68倍和3.16倍。威寧土壤的烤后煙葉平均腺毛分泌物含量在3種氣候間的差異顯著，天柱氣候最高，為最低者開陽氣候的4.73倍;當(dāng)?shù)貧夂蛳碌目竞鬅熑~平均烷烴類蠟質(zhì)含量與天柱氣候間差異未達顯著水平，顯著高于天柱氣候，分別為其2.50和2.65倍。天柱土壤的烤后煙葉平均腺毛分泌物含量3種氣候間存在顯著差異，當(dāng)?shù)貧夂蛳伦罡?，為最低者開陽氣候的3.93倍;威寧氣候下的平均烷烴類蠟質(zhì)含量顯著高于開陽氣候，為其1.44倍。由上得出，同一土壤在不同氣候條件下種植的煙葉腺毛分泌物和烷烴類蠟質(zhì)含量差異顯著，部位間的變化也有所不同。

2.2.2 同一氣候條件下不同土壤種植的烤后煙葉腺毛分泌物和烷烴類蠟質(zhì)含量差異分析

如表4所示，開陽和天柱氣候下3種土壤種植的烤后煙葉腺毛分泌物含量均隨部位升高而增加，烷烴類蠟質(zhì)含量均為上部葉＞下部葉＞中部葉。威寧氣候下3種土壤種植的烤后煙葉腺毛分泌物和烷烴類蠟質(zhì)含量都表現(xiàn)為中部葉＞上部葉＞下部葉。開陽和威寧氣候下的烤后煙葉平均腺毛分泌物和烷烴類蠟質(zhì)含量3種土壤間均無統(tǒng)計學(xué)差異。天柱氣候下，本地與開陽土壤種植的烤后煙葉平均腺毛分泌物含量基本相當(dāng)，顯著高于威寧土壤，分別為其1.41倍和1.38倍;威寧和開陽土壤種植的烤后煙葉平均烷烴類蠟質(zhì)含量差異未達顯著水平，顯著高于當(dāng)?shù)赝寥溃謩e為其1.42倍和1.28倍。綜上而言，相同氣候條件下，不同土壤種植的烤后煙葉腺毛分泌物和烷烴類蠟質(zhì)含量無統(tǒng)計學(xué)差異，其部位特征完全相同。

2.3 土壤與氣候?qū)竞鬅熑~類胡蘿卜素和表面提取物含量的影響程度比較

不同植煙土壤和氣候條件下，烤后煙葉類胡蘿卜素和表面提取物含量的變異分析(表5)表明，β-胡蘿卜素與葉黃素含量氣候間的變異系數(shù)分別為32.2%和43.1%，土壤間的變異系數(shù)分別為11.0%和22.6%。β-胡蘿卜素含量氣候間的變異度是土壤間的近3倍，葉黃素含量氣候間的變異度是土壤間的近2倍。腺毛分泌物與烷烴類蠟質(zhì)含量氣候間的變異系數(shù)分別為54.70%和36.52%，土壤間的變異系數(shù)分別為16.60%和9.35%。腺毛分泌物與烷烴類蠟質(zhì)含量氣候間的變異度分別為土壤間的3.3倍和3.9倍。按照變異系數(shù)的劃分等級:變異系數(shù)＜10%為弱變異性，變異系數(shù)為10% —100%為中等變異性，變異系數(shù)＞100% 為強變異性［19］。說明烤后煙葉類胡蘿卜素和表面提取物含量的變異都屬中等強度，它們受氣候因素的影響相對較大。

表5 不同氣候和土壤條件下烤后煙葉類胡蘿卜素和表面提取物含量的變異分析Table 5 Variation analysis on the carotenoid and cuticular extract content of cured tobacco leaves under different soils and climates

將氣候和土壤作雙因素方差分析，β-胡蘿卜素、葉黃素、腺毛分泌物與烷烴類蠟質(zhì)含量氣候間的差異均極顯著，氣候和土壤互作的差異顯著，土壤間的差異不顯著。氣候、土壤及其互作對β-胡蘿卜素含量變異的貢獻率分別為74%、9%和14%，對葉黃素含量變異的貢獻率分別為64%、12%和20%，對腺毛分泌物含量變異的貢獻率分別為61%、13%和17%，對烷烴類蠟質(zhì)含量變異的貢獻率分別為63%、7%和12%。初步判斷氣候?qū)竞鬅熑~類胡蘿卜素和表面提取物含量的影響最大，氣候與土壤互作其次，最后為土壤的影響。

2.4 烤后煙葉類胡蘿卜素和表面提取物含量與氣候及土壤因子的灰色關(guān)聯(lián)分析

烤后煙葉類胡蘿卜素和表面提取物含量與主要土壤因子及氣候因子的灰色關(guān)聯(lián)分析(表6—表9)表明，不同土壤和氣候因子與二者的關(guān)聯(lián)度和關(guān)聯(lián)序明顯不同。與β-胡蘿卜素含量關(guān)聯(lián)度較大的前10個生態(tài)因子依次為大田生長前期的累積日照時數(shù)、土壤有效鉀含量、成熟期的相對濕度、大田生長前期的累積降水量、土壤pH值、土壤有效磷含量、大田生長前期的相對濕度、成熟期的平均氣溫、成熟期的累積降水量、大田生長前期的平均氣溫，氣候因子占7個，土壤因子占3個。與葉黃素含量關(guān)聯(lián)度較大的前10個生態(tài)因子依次為大田生長前期的累積降水量和累積日照時數(shù)、成熟期的相對濕度、大田生長前期的相對濕度、土壤有效鉀含量、成熟期的平均氣溫、土壤pH值、大田生長前期的平均氣溫、土壤有效磷含量、成熟期的累積日照時數(shù)，氣候因子占7個，土壤因子占3個。與腺毛分泌物含量關(guān)聯(lián)度較大的前10個生態(tài)因子依次為大田生長前期的平均氣溫、成熟期的相對濕度、成熟期≥10℃積溫、大田生長前期的相對濕度、成熟期的平均氣溫、成熟期的累積日照時數(shù)、土壤pH值、大田生長前期的累積日照時數(shù)、土壤有效銅含量、大田生長前期≥10℃積溫。氣候因子占8個，土壤因子占2個。與烷烴類蠟質(zhì)含量關(guān)聯(lián)度較大的前10個生態(tài)因子依次為大田生長前期的累積降水量和平均氣溫、成熟期的平均氣溫、土壤有效錳含量、土壤陽離子交換量、大田生長前期≥10℃積溫、成熟期≥10℃積溫、土壤有效磷含量、大田生長前期的相對濕度、土壤有效鉀含量，氣候因子占6個，土壤因子占4個。

關(guān)聯(lián)度大，說明因素變化的勢態(tài)接近，相互關(guān)系密切;反之，相互關(guān)系疏遠［20］。綜合分析，氣候因子與類胡蘿卜素和表面提取物含量的關(guān)系明顯較土壤因子密切，與前面雙因素方差分析結(jié)果一致。影響β-胡蘿卜素和葉黃素含量的前3個氣象因子為大田生長前期的累積日照時數(shù)和累積降水量、成熟期的相對濕度，前3個土壤因子為有效鉀、有效磷含量和pH值。影響腺毛分泌物含量的前3個氣象因子為大田生長前期的平均氣溫、成熟期的相對濕度和≥10℃積溫，前3個土壤因子為有效鉀、有效銅含量和pH值。影響烷烴類蠟質(zhì)含量的前3個氣象因子為大田生長前期的累積降水量和平均氣溫、成熟期的平均氣溫，前3個土壤因子為有效錳、有效磷含量和陽離子交換量。

2.5 不同土壤耕作方式對烤后煙葉類胡蘿卜素和表面提取物含量的影響

2.5.1 不同土壤耕作方式對烤后煙葉β-胡蘿卜素和葉黃素含量的影響

在開陽、天柱和威寧對當(dāng)?shù)刂矡熗寥肋M行了打破犁底層與未打破犁底層的兩種耕作方式的比較研究(表10)。不同煙區(qū)土壤的耕作方式對三部位烤后煙葉β-胡蘿卜素和葉黃素含量的影響存在多種變化。開陽土壤打破犁底層對中部煙葉的β-胡蘿卜素和葉黃素含量影響較大，打破犁底層處理較未打破犁底層分別降低了15.5μg/g和20.2μg/g，下部和上部葉耕作方式間差異較小。威寧土壤打破犁底層對下部葉的β-胡蘿卜素和葉黃素含量影響較大，打破犁底層處理較未打破犁底層分別降低了25.1μg/g和27.3μg/g，上部和中部葉耕作方式間差異不明顯。天柱土壤打破犁底層對中部煙葉的β-胡蘿卜素和葉黃素含量影響較明顯，打破犁底層處理較未打破犁底層分別增加了8.6μg/g和20.1μg/g，下部和上部葉耕作方式間相差不大。從3個部位烤后煙葉β-胡蘿卜素和葉黃素含量平均值來看，3種植煙土壤未打破犁底層與打破犁底層間均無顯著差異，耕作方式間的差異遠小于生態(tài)區(qū)間的差異。低海拔的天柱最低，中海拔的開陽與高海拔的威寧之間差異不顯著。

2.5.2 不同土壤耕作方式對烤后煙葉腺毛分泌物與烷烴類蠟質(zhì)含量的影響

表10 不同耕作方式下烤后煙葉β-胡蘿卜素和葉黃素含量Table 10 The β-carotene and lutein content of the cured tobacco leaves under different tillage methods

表11 不同耕作方式下烤后煙葉腺毛分泌物與烷烴類蠟質(zhì)含量Table 11 The trichome secretions and alkane waxiness content of the cured tobacco leaves under different tillage methods

表11表明，不同煙區(qū)土壤的耕作方式對3個部位烤后煙葉腺毛分泌物與烷烴類蠟質(zhì)含量的影響明顯不同。開陽土壤打破犁底層對中部煙葉腺毛分泌物與烷烴類蠟質(zhì)含量影響較大，打破犁底層較未打破犁底層分別提高36.54μg/g和21.04μg/g，下部和上部葉耕作方式間差異較小。威寧土壤打破犁底層對下部葉的腺毛分泌物與烷烴類蠟質(zhì)含量影響較大，打破犁底層較未打破犁底層分別增加23.39μg/g和89.21μg/g，上部和中部葉耕作方式間差異不明顯。天柱土壤打破犁底層對中部葉腺毛分泌物與烷烴類蠟質(zhì)含量影響較明顯，打破犁底層較未打破犁底層分別增加35.08μg/g和23.04μg/g，下部和上部葉耕作方式間相差不大。從烤后煙葉腺毛分泌物與烷烴類蠟質(zhì)含量3個部位平均值來看，3種植煙土壤未打破犁底層與打破犁底層間的差異不顯著，耕作方式間的差異遠小于生態(tài)區(qū)之間的差異。低海拔天柱的腺毛分泌物與烷烴類蠟質(zhì)含量均最高，中海拔的開陽與高海拔的威寧間差異未達顯著水平。烷烴類蠟質(zhì)含量中間香型的開陽最低，清香型的威寧和天柱間無統(tǒng)計學(xué)差異。

3 討論

類胡蘿卜素是煙葉中的重要香氣前體物，在煙葉成熟、調(diào)制、醇化和燃燒過程中可降解轉(zhuǎn)化形成多種體現(xiàn)煙草特征香味的物質(zhì)［21-22］。如葉黃素發(fā)生雙鍵斷裂可生成3-羥基-α-紫羅蘭酮，進一步轉(zhuǎn)化形成巨豆三烯酮［23］，β-胡蘿卜素在脂氧合酶作用下可形成β-紫羅蘭酮和二氫獼猴桃內(nèi)酯等［24］。煙草葉面分泌物在烘烤調(diào)制過程中除少部分降解轉(zhuǎn)化或揮發(fā)損失外，大部分仍留存于葉面或滲透到葉表皮下細胞間隙，形成煙葉油分和其它致香物質(zhì)［1］。冀浩等［25］研究認為，煙葉表面提取物缺失對評吸質(zhì)量產(chǎn)生負面影響，香氣質(zhì)量下降。因此，通過適宜的調(diào)控技術(shù)，煙葉生長和成熟期間促進類胡蘿卜素的合成積累，烘烤過程中使其適當(dāng)降解，有利于改善煙葉香氣品質(zhì);提升烤后煙葉表面提取物含量，有助于豐富芳香類型。

烤后煙葉β-胡蘿卜素和葉黃素含量地域性差異明顯，在原地土壤和氣候因素的綜合作用下，中海拔開陽煙區(qū)最高，高海拔威寧煙區(qū)稍低，二者間差異較小;低海拔天柱煙區(qū)顯著低于開陽和威寧。說明在低緯度高海拔地區(qū)，類胡蘿卜素容易積累，與韓錦峰等［26］研究結(jié)果相吻合。類胡蘿卜素是保護葉綠素免受強光破壞的色素類物質(zhì)［27］，高海拔煙區(qū)紫外線強度強，可能誘使煙葉類胡蘿卜素合成關(guān)鍵酶基因表達增強，合成更多類胡蘿卜素以減輕高光強對葉綠素的破壞程度［28］。烤煙生長后期多雨寡照和相對較低的氣溫導(dǎo)致類胡蘿卜素分解代謝減緩［29］，增加了其積累量。但海拔高度對煙葉β-胡蘿卜素和葉黃素含量的影響存在閾值現(xiàn)象，表現(xiàn)為高海拔威寧煙葉β-胡蘿卜素和葉黃素含量卻低于中海拔開陽煙區(qū)，有待于進一步研究分析。清香型烤煙類胡蘿卜素含量顯著高于中間香型烤煙［30］，低海拔天柱煙葉β-胡蘿卜素和葉黃素含量不高，其獨特清香型風(fēng)格的形成可能與各種類胡蘿卜素降解產(chǎn)物的協(xié)調(diào)性有關(guān)。天柱和威寧烤后煙葉的表面提取物含量明顯高于開陽，說明清香型煙葉的表面提取物含量高于中間香型，周冀衡等［31］的研究也證明了這一點，較高的腺毛分泌物與烷烴類蠟質(zhì)含量可能是形成清香型煙葉風(fēng)格特色的主要因素之一。

不同生態(tài)因子對烤后煙葉類胡蘿卜素和表面提取物含量的影響程度明顯不同，類胡蘿卜素含量氣候間的變異度是土壤的2—3倍，表面提取物含量氣候間的變異度是土壤的3—4倍。氣候的貢獻矢量遠大于土壤，氣候、土壤及其互作對β-胡蘿卜素含量變異的貢獻率分別為74%、9%和14%，對葉黃素含量變異的貢獻率分別為64%、12%和20%，對腺毛分泌物含量變異的貢獻率分別為61%、13%和17%，對烷烴類蠟質(zhì)含量變異的貢獻率分別為63%、7%和12%。說明氣候因素是影響烤后煙葉類胡蘿卜素和表面提取物含量的關(guān)鍵生態(tài)因子，土壤的影響主要是通過與氣候互作起作用。類胡蘿卜素和表面提取物含量作為煙葉重要的致香前體物質(zhì)，對煙葉的品質(zhì)和風(fēng)格具有重要影響。因此，在特色優(yōu)質(zhì)煙葉的區(qū)域定位時，應(yīng)重點考慮氣候因素。烤煙生產(chǎn)中，充分認識到氣候條件的重要性，與品種和栽培調(diào)制等有效結(jié)合起來，共同發(fā)揮生態(tài)優(yōu)勢，更加突出煙葉品質(zhì)和香氣風(fēng)格，充分彰顯質(zhì)量特色。

灰色關(guān)聯(lián)分析表明，與類胡蘿卜素和表面提取物含量關(guān)聯(lián)度較大的前10個生態(tài)因子中，氣候因子占6—8個，土壤因子為2—4個，進一步證實氣候因子與烤后煙葉類胡蘿卜素和表面提取物含量的關(guān)系較土壤因子密切。影響類胡蘿卜素含量的前3個氣候因子為大田生長前期的累積日照時數(shù)和累積降水量、成熟期的相對濕度;生長前期氣候因子主要影響類胡蘿卜素合成關(guān)鍵酶基因的表達，后期氣候因子主要影響類胡蘿卜素的分解代謝。前3個土壤因子為有效鉀、有效磷含量和pH值，鄧小華等［32］研究結(jié)果一致。腺毛分泌物含量的前3個氣象影響因子為大田生長前期的平均氣溫、成熟期的相對濕度和≥10℃積溫。崔紅等［33］認為河南和云南煙區(qū)葉齡60d的中部葉面腺毛中基因的表達差異與河南煙區(qū)7月中上旬高熱少雨，云南煙區(qū)此時的相對低溫多雨氣候特征有關(guān)，從分子水平證實了上述結(jié)果。烷烴類蠟質(zhì)含量的前3個氣象影響因子為大田生長前期的累積降水量和平均氣溫、成熟期的平均氣溫。一次暴雨、急雨可沖掉煙葉表面物質(zhì)20%以上，降低葉片表面分泌物的含量［34］，推測降水量的多少與保持葉面烷烴類蠟質(zhì)有一定關(guān)系。腺毛分泌物含量的前3個土壤影響因子為有效鉀、有效銅含量和pH值，烷烴類蠟質(zhì)含量的前3個土壤影響因子為有效錳、有效磷含量和陽離子交換量。選擇有效鉀和有效錳含量高的土壤，有利于增加煙葉表面分泌物的含量，改善烤煙香味品質(zhì)。

不同氣候相同土壤所產(chǎn)煙葉的類胡蘿卜素含量的部位特征完全相同，相同氣候不同土壤所產(chǎn)煙葉的類胡蘿卜素含量的部位特征差異較大，說明土壤因子對煙葉類胡蘿卜素含量部位特征的影響效果較氣候因子突出，這與土壤因子對烤煙的營養(yǎng)供給、碳氮代謝和煙葉成熟度產(chǎn)生直接影響有一定關(guān)系。同一土壤在不同氣候條件下種植煙葉的表面提取物含量在部位間的變化各異，相同氣候條件下不同土壤種植的烤后煙葉表面提取物含量部位特征完全相同，說明氣候因子對煙葉表面提取物含量部位特征的影響較土壤因子明顯。究其原因主要是煙草葉面分泌物生物合成和分泌過程所需的前體物質(zhì)和能源，部分或全部由自身的光合作用提供，氣候因子對光合作用有著更直接的影響。煙葉類胡蘿卜素和表面提取物含量的部位效應(yīng)是生態(tài)條件、遺傳因素和栽培技術(shù)共同作用的結(jié)果，部位間差異的詳細機制有待于進一步研究。不同耕作方式對烤后煙葉類胡蘿卜素和表面提取物含量無明顯影響，耕作方式間的差異遠小于生態(tài)區(qū)間的差異。說明生態(tài)環(huán)境對煙葉類胡蘿卜素和表面提取物含量的主導(dǎo)性，在特色煙葉香氣風(fēng)格的形成機理研究中，應(yīng)重視生態(tài)基礎(chǔ)研究。

［1］ Zuo T J.Tobacco Production Physiology and Biochemistry.Shanghai:Shanghai Far East Publishers，1993:385-396.

［2］ Johnson A W.Tobacco leaf trichomes and their exudates.Tob Sci，1985，29:67-72.

［3］ Severson R F.Quantination of major cuticular components from green leaf of different tobacco type.J Agric Food Chem，1984，32:566-570.

［4］ Zhu X L，Pan W J，Chen Y，Chen W，Li Z H，Zhang J L，Xu Z H，Li H X.Analysis of major cuticular components extracted from green leaves of different flue-cured tobacco varieties.Chinese Tobacco Science，2011，32(3):51-56.

［5］ Zhao M Q，Zhang Z F，Ji X M.The study on chromoplast pigments and chemical components in flue-cured tobacco leaves from different sites and different growing position.Acta Agculturae UniVersitatis Jiangxiensis，2009，3l(2):241-219.

［6］ Yang H Q，Zhou J H，Luo Z M，Yang S Y.Study on chromoplast pigments and its degrading products of the flue-cured tobacco from different producting reginons in china.Journal of Southwest Agricultural University(Nat Sci)，2004，26(5):640-644.

［7］ Pang T，Song C M，Zhang Y H，F(xiàn)ang D H，Deng J H，Lu X P，Deng Y L..Difference analysis on chemical constituents and aroma components between flue-cured tobacco cultivars from Yunnan Province and Zimbabwei.Journal of Gansu Agricultural University，2010，45(1):62-71.

［8］ Yin Q Y，Wang X，Yang T Z，Wang X H.Studies on leaf cuticular extraction and neutral aroma components in flue-cured tobacco genotypes and regions and its relation to routine chemical components.Acta Tabacaria Sinica，2010，16(3):17-23.

［9］ Jia Y C，Liu P Y，Yang T Z，Zhang X Q，Zhao Y B，Li Z J，Zhao W C.Analysis of difference in aroma constituents of flue-cured tobacco among different genotypes in different ecological regions.Acta Agriculturae Jiangxi，23(1):31-34.

［10］ Li Z H，Li J X，Pan W J，Liang G L，Zhu X L.Cuticular component variations of cured tobacco leaves from different ecological regions in guizhou and their effects on leaf styles.Chinese Tobacco Science，2011，32(5):1-5.

［11］ Weybrew J A.Estimmion of the plastid pigments in tobacco.Tobacco Science，1957(1):1-5.

［12］ Chang S Y，Grunwald C.Duvatrienediol，alkanes，and fatty acids in cuticular wax of tobacco leaf of various physiological maturity.Phytochemistry，1976(15):961-963.

［13］ Severson R F，Jackson D M，Chaplin J F.The effect of plant age and curing on cuticular leaf chemical levels and composition［C］.36th TCRC，1982.

［14］ Wang S B，Zheng H T，Shao Q Q.SPSS Statistical and Analysis.Beijing:Mechanical Industry Press，2003.

［15］ Cohen J.Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences.Hillsdale，NJ:Lawrence Erlbaum Associates，1988.

［16］ Yuan Z J.Grey System Theory and Application.Beijing:Science Press，1991:11-34.

［17］ Zhou J H，Wang Y，Shao Y，Yang H Q，Li Y P，Zhu L S.The comparison on the content of chromoplast pigments and volatile aromatic materials of flue-cured tobacco from domestic and abroad.Journal of Hunan Agricultural University:Natural Science，2005，31(2):128-132.

［18］ Song Z P，GAO Y，Wu S J，Xu Z C，Gong C R，Zhang W J.The degradation mechanism of carotenoids in flue-cured tobacco and the changes of the related enzymes activities at leaf-drying stage during the bulk curing process.Scientia Agricultura Sinica，2009，42(8):2875-2881.

［19］ Lei Z D，Yang S X，Xu Z R，G·Vachaud.Preliminary investigation of the spatialvariability of soil properties.Journal of Hydraulic Engineering，1985，16(9):10-21.

［20］ Liu L X，Sun Q X，Wang S Y.Preliminary study on the synthetic evaluation of new crop variety with the application of Grey System Theory(in Chinese).Scientia Agricultra Sicica，1989，22(3):22-27.

［21］ Gong C R，Zhao M Q，Wang Y F，Li R.Study on the characteristics of pigment degradation in tobacco leaf under different curing conditions.Tobacco Science＆ Technology，1997(2):33-34.

［22］ Wahlberg I，Kerstin K，Austin D J.Effects of flue-curing and ageing on the volatile，neutral and acidic constituents of Virginia tobacco.Pyhtochemistry，1977，6:1217-1231.

［23］ Hou Y，Xu J C，Wang B X，Yang Y，Yang Y，Wang Y U，Liu J.Analysis of pyrolytic products of lutin.Tobacco Science＆ Technology，2007(12):27-32.

［24］ Gopalam A，Gopalachari N C.Biochemical changes in leaf pigments and chemical constituents during flue-curing of tobacco.Tob Res，1979，5:113-117.

［25］ Ji H，Li X，Zhao Y Z，Zhang H，Wei Y W，Cui H.Effect of leaf surface exudate extraction on flue-cured tobacco quality.Chinese Tobacco Science，2008，29(2):13-17.

［26］ Han J F，Liu W Q，Yang S Q，Lu Q L，Han f G，Hong T，Wang Y T，Hou W H，Hang Y J.Effect of altitude on aroma substances in flue-cured tobacco.Chinese Tobacco Science，1993(3):1-3.

［27］ Tracewell C A，Vrettos J S，Bautista J A，F(xiàn)rank H A，Brudvig G W.Carotenoid photooxidation in photosystem Ⅱ.Archives of Biochemistry and Biophysics，2001，385:61-69.

［28］ Xu C J，Zhang S L.Carotenoid biosynthesis and its regulation in plants.Plant Physiology Communications，2000，36(1):64-67.

［29］ Zhao C N，Zhao E W，Xiao B G，Zeng J M，Deng Y L，Yao S S，Zhu X Y，Cui H.Comparative dynamic analyses of plastid pigment biosynthesis of flue-cured tobacco growing in different ecological regions of China.Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica，2010，19(12):68-71.

［30］ Xi Y X，Wei C Y，Song J Z，Zhou H P，Liu Y，Guo W M，Zhang S X.Content variance of some chemical components in flue-cured tobacco of different flavor styles.Tobacco Science＆ Technology，2011，5:29-33.

［31］ Zhou J H，Yang H Q，Lin G H，Yang S Y.Studies on the Main Volatile Aroma Components in Tobacco from Different Flue-Cured Tobacco Production Regions.Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2004，30(1):20-23.

［32］ Deng X H，Xie P F，Peng X H，Yi J H，Zhou J H，Zhou Q M，Pu W X，Dai Y G.Effects of soil，climate，and their interaction on some neutral volatile aroma components in Flue-cured tobacco leaves from high quality tobacco planting regions of Hunan Province.Chinese Journal of Applied Ecology，2010，21(8):2063-2071.

［33］ Cui H，Ji H，Yang H J，Xiao B G，Zeng J M，Deng Y L.Comparative gene expression analysis for leaf trichomes of tobacco grown in two different regions in China.Acta Ecologica Sinica，2011，31(11):3143-3149.

［34］ Sereson R F，Johnson A W，Jockson D M.Cuticular constituents of tobacco:factors affecting their production and their role in insect and disease resistance and smoke quality.Rec Adv Tob Sci，1985，11:105-173.

參考文獻:

［1］ 左天覺.煙草的生產(chǎn)、生理和生物化學(xué).上海:上海遠東出版社，1993:385-396.

［4］ 朱顯靈，潘文杰，陳懿，陳偉，李章海，張紀利，徐增漢，李洪勛.不同烤煙品種鮮葉表面提取物主要成分分析.中國煙草科學(xué)，2011，32(3):51-56.

［5］ 趙銘欽，張志逢，姬小明.不同地區(qū)及部位烤煙煙葉中質(zhì)體色素與常規(guī)化學(xué)成分含量的有關(guān)分析.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，3l(2):241-219.

［6］ 楊虹琦，周冀衡，羅澤民，楊述元.不同產(chǎn)區(qū)烤煙中質(zhì)體色素及降解產(chǎn)物的研究.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2004，26(5):640-644.

［7］ 逢濤，宋春滿，張誼寒，方敦煌，鄧建華，盧秀萍，鄧云龍.云南與津巴布韋烤煙品種煙葉化學(xué)成分和致香成分差異分析.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，45(1):62-71.

［8］ 殷全玉，王霞，楊鐵釗，王新法.葉面分泌物和中性香氣物質(zhì)在不同烤煙品種(系)和地區(qū)間的變化及其與常規(guī)化學(xué)成分的關(guān)系.中國煙草學(xué)報，2010，16(3):17-23.

［9］ 賈燕超，劉培玉，楊鐵釗，張小全，趙云波，李占杰，趙偉才.不同生態(tài)區(qū)烤煙基因型間煙葉基礎(chǔ)香味物質(zhì)的差異分析.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，23(1):31-34.

［10］ 李章海，李繼新，潘文杰，梁貴林，朱顯靈.貴州不同生態(tài)區(qū)域烤后煙葉表面提取物差異及其對煙葉風(fēng)格的影響.中國煙草科學(xué)，2011，32(5):1-5.

［14］ 王蘇斌，鄭海淘，邵謙謙.SPSS統(tǒng)計分析.北京:機械工業(yè)出版社，2003.

［16］ 袁嘉祖.灰色系統(tǒng)理論及其應(yīng)用.北京:科學(xué)出版社，1991:11-34.

［17］ 周冀衡，王勇，邵巖，楊虹琦，李永平，朱列書.產(chǎn)煙國部分煙區(qū)烤煙質(zhì)體色素及主要揮發(fā)性香氣物質(zhì)的含量比較.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2005，31(2):128-132.

［18］ 宋朝鵬，高遠，武圣江，許自成，宮長榮，張衛(wèi)建.密集烘烤定色期煙葉類胡蘿卜素降解及相關(guān)酶活性變化.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42(8):2875-2881.

［19］ 雷志棟，楊詩秀，許志榮，G·瓦肖爾.土壤特性空間變異初步研究.水利學(xué)報，1985(9):10-21.

［20］ 劉錄祥，孫其信，王士蕓.灰色系統(tǒng)理論用于作物新品種綜合評估初探.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1989，22(3):22-27.

［21］ 宮長榮，趙銘欽，汪耀富，李銳.不同烘烤條件下煙葉色素降解規(guī)律的研究.煙草科技，1997(2):33-34.

［23］ 侯英，徐濟倉，王保興，楊燕，楊勇，王玉，劉靜.葉黃素的熱解產(chǎn)物分析.煙草科技，2007(12):27-32.

［25］ 冀浩，李雪君，趙永振，張華，魏躍偉，崔紅.浸提葉面分泌物對烤煙品質(zhì)的影響.中國煙草科學(xué)，2008，29(2):13-17.

［26］ 韓錦峰，劉衛(wèi)群，楊素勤，呂巧玲，韓富根，洪濤，王彥亭，侯文華，黃元炯.海拔高度對烤煙香氣物質(zhì)的影響.中國煙草，1993(3):1-3.

［28］ 徐昌杰，張上隆.植物類胡蘿卜素的生物合成及其調(diào)控.植物生理學(xué)通訊，2000，36(1):64-67.

［29］ 趙宸楠，趙二衛(wèi)，肖炳光，曾建敏，鄧云龍，姚姍姍，朱曉宇，崔紅.不同生態(tài)區(qū)烤煙質(zhì)體色素生物合成規(guī)律及色素含量比較.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，19(12):68-71.

［30］ 席元肖，魏春陽，宋紀真，周漢平，劉陽，過偉民，張仕祥.不同香型烤煙化學(xué)成分含量的差異.煙草科技，2011，5:29-33.

［31］ 周冀衡，楊虹琦，林桂華，楊述元.不同烤煙產(chǎn)區(qū)煙葉中主要揮發(fā)性香氣物質(zhì)的研究.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2004，30(1):20-23.

［32］ 鄧小華，謝鵬飛，彭新輝，易建華，周冀衡，周清明，蒲文宣，代遠剛.土壤和氣候及其互作對湖南烤煙部分中性揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量的影響.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2010，21(8):2063-2071.

［33］ 崔紅，冀浩，楊惠絹，肖炳光，曾建敏，鄧云龍.不同生態(tài)區(qū)煙草的葉面腺毛基因表達.生態(tài)學(xué)報，2011，31(11):3143-3149.