盧振峰，秦春華，楊 艷，劉莉莉，俞 英，吳宏軍，劉愛(ài)榮，王雅春＊，史遠(yuǎn)剛

產(chǎn)奶性狀是受微效多基因控制的數(shù)量性狀，到目前為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)其進(jìn)行了一系列研究，發(fā)現(xiàn)了眾多能對(duì)其產(chǎn)生影響的基因位點(diǎn)。其中，三磷酸腺苷（ATP）結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員2（ATP－binding cassette super－family G member 2，ABCG2）基因突變被認(rèn)為是影響產(chǎn)奶性狀的一個(gè)比較重要的基因。

三磷酸腺苷（ATP）結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員2（ATP－binding cassette super－family G member 2，ABCG2）基因，位于牛6號(hào)染色體上［1］。Olsen等［2］在BTA6上發(fā)現(xiàn)1個(gè)影響產(chǎn)乳性狀的QTL，ABCG2基因包含在此QTL中，之后在土耳其荷斯坦牛［3］、波蘭荷斯坦牛［4］等牛群中都檢測(cè)到ABCG2基因突變。2005年，Cohen－Zinder［5］和 Olsen［6］等分別在瑞士紅牛和以色列荷斯坦牛群體中研究發(fā)現(xiàn)ABCG2存在一個(gè)A－G的突變，該突變與低產(chǎn)乳量和高乳蛋白率、高乳脂率密切相關(guān)。此研究中的Y367C突變位于ABCG2基因的第9外顯子區(qū)，由堿基A－G的突變引起，并導(dǎo)致氨基酸由酪氫酸突變?yōu)榘腚装彼帷?/p>

本研究以內(nèi)蒙古三河牛為研究群體，分析ABCG2基因Y367C位點(diǎn)在三河牛群中的多態(tài)性，并分析其與產(chǎn)奶性狀之間的關(guān)系，以其為利用分子標(biāo)記輔助技術(shù)提高三河牛產(chǎn)奶性能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)群體

本研究的試驗(yàn)樣品為從內(nèi)蒙古呼倫貝爾市海拉爾區(qū)謝爾塔拉牛場(chǎng)核心群采集的181頭三河牛的EDTA抗凝血樣品。

產(chǎn)奶數(shù)據(jù)來(lái)自謝爾塔拉牛場(chǎng)，包括：305d產(chǎn)奶量（MY）、乳脂量（FY）、乳蛋白量（PY）、乳脂率（FP）、乳蛋白率（PP）、體細(xì)胞評(píng)分（SCS）。其中，體細(xì)胞評(píng)分與體細(xì)胞計(jì)數(shù)（SCC）的轉(zhuǎn)換公式為：

1.2 ABCG2基因Y367C位點(diǎn)的檢測(cè)

位點(diǎn)檢測(cè)和群體分型選擇的是Sequenom Mass ARRAY Genotype分型技術(shù)，Y367C位點(diǎn)檢測(cè)的是A堿基和G堿基，以Y和C表示。

利用Sequenom Assay design軟件設(shè)計(jì)引物序列，針對(duì)Y367C位點(diǎn)A／G突變的引物有三條：PCR擴(kuò)增引物 R＇－ACGTTGGATGGCCTGGAAATCCATTT－GAGC 和 R＇－GGCATAAGTGACCTCCTTGC，單堿基延伸引物R＇－GGCATAAGTGACCTCCTTG。分型試驗(yàn)由博淼生物科技（北京）有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)檢測(cè)的基因型結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算基因型頻率、基因頻率，并進(jìn)行 Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)。用SAS 9.1軟件的一般線性模型（GLM）對(duì)基因型效應(yīng)進(jìn)行分析。采用固定效應(yīng)模型：Y＝μ＋Year＋Season＋Parity＋SNP＋e，其中Y為性狀表型值，μ為群體平均值，Year為產(chǎn)犢年效應(yīng)，Season為產(chǎn)犢季節(jié)效應(yīng)，Parity為胎次效應(yīng)，SNP為基因型效應(yīng)，e為隨機(jī)殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP分型結(jié)果

Sequenom Mass ARRAY Genotype分型技術(shù)直接給出每個(gè)個(gè)體在兩個(gè)SNP位點(diǎn)的分型結(jié)果。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)，基因頻率、基因型頻率見(jiàn)表1，遺傳多樣性指標(biāo)見(jiàn)表2。從表中可以看出，ABCG2位點(diǎn)的YY基因型頻率為0.96，為優(yōu)勢(shì)基因型。此位點(diǎn)的MAF（最小等位基因頻率）值為0.02，PIC（多態(tài)信息含量）值小于0.25，為低度多態(tài)。Hardy－Weinberg平衡檢測(cè)結(jié)果顯示，Y367C在此三河牛群體中處于平衡狀態(tài)（P＜0.05）。

表1 Y367C位點(diǎn)的基因型頻率和基因頻率

表2 Y367C位點(diǎn)多態(tài)性分析以及Hardy－weinberg檢驗(yàn)

2.2 與產(chǎn)奶性狀的關(guān)聯(lián)分析

利用最小二乘法對(duì)三河牛體細(xì)胞評(píng)分（SCS）、305d產(chǎn)奶量（MY）、乳脂率（FP）、乳蛋白率（PP）、乳脂量（FY）、乳蛋白量（PY）進(jìn)行方差分析和基因替代效應(yīng)分析。結(jié)果見(jiàn)表3和表4。

方差分析結(jié)果（表3）顯示：ABCG2基因Y367C位點(diǎn)的YY基因型具有最低的體細(xì)胞評(píng)分和最高的乳蛋白率；YC基因型個(gè)體具有最高的乳脂率；CC個(gè)體有最高的產(chǎn)奶量、乳脂量、乳蛋白量。但三種基因型差異均不顯著（P＞0.05）。

基因效應(yīng)分析結(jié)果（表4）顯示：Y等位基因降低體細(xì)胞評(píng)分，提高了乳蛋白率；而C等位基因則有助于提高產(chǎn)奶量、乳脂率，乳脂量和乳蛋白量。

表3 Y367C位點(diǎn)不同基因型產(chǎn)奶性狀的最小二乘均值

表4 Y367C位點(diǎn)基因效應(yīng)分析結(jié)果

3 討論

本研究首次在三河牛群體中檢測(cè)ABCG2基因的Y367C突變，并發(fā)現(xiàn)Y367C位點(diǎn)的YY基因型為優(yōu)勢(shì)基因型，Y367C位點(diǎn)為低度多態(tài)，Hardy－Weinberg平衡檢測(cè)結(jié)果顯示，此SNP在三河牛群體中均處于平衡狀態(tài)（P＜0.05），表明在該群體中的人工選育對(duì)這此基因座的選擇壓不強(qiáng)。

路國(guó)彬等［8］在中國(guó)荷斯坦奶牛中ABCG2基因的第九外顯子進(jìn)行了研究，檢測(cè)到Y(jié)367C突變位點(diǎn)，分析發(fā)現(xiàn)YY型為優(yōu)勢(shì)基因型，CC基因型個(gè)體產(chǎn)奶性能優(yōu)于其余基因型個(gè)體，但差異不顯著。而本試驗(yàn)是第一次在三河群體牛中檢測(cè)Y367C位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)純合子YY基因型為優(yōu)勢(shì)基因型，CC基因型個(gè)體在產(chǎn)奶性能方面也優(yōu)于其余基因型個(gè)體，但同樣未發(fā)現(xiàn)顯著差異。

本研究通過(guò)對(duì)ABCG2基因的Y367C位點(diǎn)進(jìn)行了與產(chǎn)奶性狀的相關(guān)性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此位點(diǎn)三種基因型表型值差異不顯著，這與路國(guó)彬等的研究結(jié)果一致。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)ABCG2基因進(jìn)行了大量研究，但大部分都是針對(duì)的 Y581S 突變［9－13］，對(duì)Y367C的報(bào)道非常罕見(jiàn)。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然在三河牛群體中CC基因型個(gè)體在產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量方面優(yōu)于YY基因型個(gè)體和CC基因型個(gè)體，但差異并不顯著。這主要是由于本試驗(yàn)群體數(shù)量有限，導(dǎo)致有些基因型個(gè)體的數(shù)量太少，如CC基因型個(gè)體僅檢測(cè)到一個(gè)，誤差會(huì)不可避免地增大，下一步試驗(yàn)應(yīng)擴(kuò)大群體的規(guī)模進(jìn)一步驗(yàn)證此位點(diǎn)的功能。

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