童明敏 TONG Mingmin

史玉振 SHI Yuzhen

吳越霏 WU Yuefei

王中秋 WANG Zhongqiu

胰腺癌是我國(guó)比較常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，惡性程度高且預(yù)后差[1]，因此，早期診斷非常重要。近年隨著磁性納米粒子技術(shù)的飛速發(fā)展，MR分子靶向成像逐漸成為研究熱點(diǎn)[2-4]，Yang等[2,5]成功研制的雙模態(tài)靶向探針同時(shí)具有MR成像和熒光成像雙重功能，并成功完成了動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)。生存素（Survivin）除在胚胎發(fā)育組織中表達(dá)外，主要在腫瘤組織中常見(jiàn)[6,7]，如胰腺癌、肺癌、胃癌等組織，在正常的成熟組織中幾乎不表達(dá)，因此，Survivin可能是早期分子水平診斷及治療胰腺癌的理想靶標(biāo)。本研究以氧化鐵磁性納米顆粒（成分γ-Fe2O3）作為MR陰性對(duì)比劑載體標(biāo)志Survivin反義基因，構(gòu)建靶向Survivin的胰腺癌特異性分子探針（Sur-MNPs），并完成體外細(xì)胞成像的初步研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3由南京市源端生物公司提供，Survivin反義寡核苷酸（ASON）由上海生工生物有限公司合成，5'末端修飾羧基。采用Sigma RPMI-1640培養(yǎng)基、殼聚糖，凱基Annexin V-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。CO2培養(yǎng)箱，凈化工作臺(tái)（蘇州生化凈化設(shè)備廠），Siemens 1.5T MRI儀，美國(guó)BioTek公司ELx800酶標(biāo)儀，KC4_32分析軟件，美國(guó)BD公司FACS Calibur 6.0流式細(xì)胞儀，分析采用Cell Quest Pro軟件。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 納米材料的制備與修飾 采用共沉淀法制備γ-Fe2O3納米顆粒，用殼聚糖修飾MNPs，所得納米顆粒分散于雙蒸水中，調(diào)節(jié)pH=5左右，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 靶向探針的合成及連接情況檢驗(yàn) 取Survivin反義核苷酸加入5 μl碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺，室溫振蕩（200 r/min，20 min），然后與殼聚糖修飾的γ-Fe2O3磁性納米顆粒（CS@MNPs）按1︰10和1︰30混合，繼續(xù)振蕩2 h，根據(jù)羧基和氨基的反應(yīng)，將反義核苷酸連接到CS@MNPs表面。反應(yīng)結(jié)束后用磁分離法洗滌2～3次，最終將得到的靶向探針顆粒重懸于MES緩沖液中（pH=5.5）。取上清液及Sur-MNPs分別進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外線觀察儀上觀察拍照。另設(shè)3-氨丙基三乙氧基硅烷修飾的納米材料（ATPS@MNPs）與Survivin反義核苷酸以1︰30反應(yīng)作為對(duì)照，對(duì)比分析CS@MNPs與反義核苷酸的連接能力。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞以1×104個(gè)/ml接種于6孔板，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，3～4 d更換RPMI-1640培養(yǎng)液。

1.2.3.1 細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組為CS@MNPs，對(duì)照組為未修飾的MNPs。胰腺癌細(xì)胞分別與CS@MNPs及MNPs培養(yǎng)24 h后，再加入5 mg/ml MTT 20 μl，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，用PBS洗滌2遍，每孔加入150 μl二甲基亞砜，振蕩10 min使結(jié)晶充分溶解。用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率，比較經(jīng)殼聚糖修飾前后的納米顆粒對(duì)細(xì)胞活力的影響。

1.2.3.2 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞孵育24 h后，用Annexin V-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行細(xì)胞染色，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。采用Cell Quest Pro軟件，細(xì)胞儀用激發(fā)波長(zhǎng)488 nm氬綠光激發(fā)器激發(fā)。

1.2.3.3 普魯士藍(lán)染色 胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染CS@MNPs、MNPs、Sur-MNPs后除去培養(yǎng)液，以PBS漂洗3次，4%戊二醛固定、漂洗，加入普魯士藍(lán)染色液（2%酸性亞鐵氰化鉀與2%鹽酸等比例混合）孵育20 min，漂洗，核固紅復(fù)染5～10 s，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.3.4 MRI分析 將孵育不同材料的細(xì)胞收集于EP管中，以純凈水及未孵育任何納米材料的空白細(xì)胞作為對(duì)照，2000 r/min離心3 min，棄上清，重懸于1%瓊脂糖1 ml中，并迅速吹打混勻，待冷。另外取1 ml蒸餾水于EP管中作對(duì)照。細(xì)胞懸液在1.5T MR 掃描T2WI（TR 2500 ms，TE 20 ms，16個(gè)回波，視野1.5 cm×1.5 cm），測(cè)量T2值。

2 結(jié)果

2.1 透射電鏡結(jié)果 CS@MNPs大小均勻、核心粒徑核心在20 nm左右。

2.2 納米顆粒與DNA的結(jié)合能力 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1）顯示在第1、2、5泳道內(nèi)見(jiàn)明顯的亮帶，即CS@MNPs與反義核苷酸在比例為1∶10、1∶30時(shí)均能有效連接，電泳遷移率水平與單純反義核苷酸相似，且兩種溶液洗滌的上清液中未見(jiàn)亮的條帶影，說(shuō)明大部分反義核苷酸已連接到納米顆粒表面；而對(duì)照組ATPS@MNPs所在泳道未見(jiàn)明顯的條帶。

圖1 瓊脂糖電泳結(jié)果。第1～6泳道分別為單純的ASON、ASON︰CS@MNPs=1︰10的溶液、ASON︰CS@MNPs=1︰10、ASON︰ATPS@MNPs=1︰30、ASON︰CS@MNPs=1︰30、ASON︰CS@MNPs=1︰30的上清液

2.3 細(xì)胞普魯士藍(lán)染色結(jié)果 未轉(zhuǎn)染納米顆粒的細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)藍(lán)色鐵顆粒，而經(jīng)納米顆粒轉(zhuǎn)染的兩組細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)均見(jiàn)大量藍(lán)色鐵顆粒（圖2）。

圖2 細(xì)胞分別與不同納米材料孵育24 h后的普魯士藍(lán)染色結(jié)果。A.細(xì)胞與CS@MNPs孵育（×200）；B.細(xì)胞與靶向探針?lè)跤ā?00）；C.細(xì)胞與MNPs孵育（×200）；D.空白對(duì)照組，未孵育任何材料（×200）

2.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果 未轉(zhuǎn)染納米顆粒、經(jīng)MNPs轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染CS@MNPs組的細(xì)胞總凋亡率分別為34.31%、67.73%、42.88%，經(jīng)MNPs轉(zhuǎn)染的細(xì)胞總凋亡率高于未轉(zhuǎn)染納米顆粒和轉(zhuǎn)染CS@MNPs組的細(xì)胞，見(jiàn)圖3。

圖3 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果。A.未轉(zhuǎn)染納米顆粒的細(xì)胞組，總凋亡率為34.31%；B.轉(zhuǎn)染MNPs的細(xì)胞組，總凋亡率為67.73%；C.轉(zhuǎn)染CS@MNPs的細(xì)胞組，凋亡率為42.88%。細(xì)胞總凋亡率為前期凋亡+后期凋亡，即右上象限+右下象限分布的細(xì)胞

圖4 細(xì)胞存活率曲線。細(xì)胞CS@MNPs和MNPs(γ-Fe2O3)分別孵育24 h（鐵濃度25 μg/ml），隨著溶液中鐵濃度的增加，細(xì)胞活力呈遞減趨勢(shì)

2.5 細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 細(xì)胞存活率隨著納米顆粒濃度的增加而降低，且在相同鐵濃度下，MNPs孵育的細(xì)胞活力均比CS@MNPs低（圖4）。鐵濃度為25 μg/ml時(shí) MNPs、CS@MNPs組的細(xì)胞活力分別為46.43%、63.68%，半數(shù)抑制濃度分別為29.63 μg/ml、56.23 μg/ml。

2.6 MR結(jié)果 隨著T2時(shí)間的延長(zhǎng)，納米顆粒孵育的細(xì)胞信號(hào)逐漸降低（圖5），空白對(duì)照組細(xì)胞、標(biāo)志MNPs的細(xì)胞、標(biāo)志CS@MNPs的細(xì)胞、孵育靶向探針的細(xì)胞的T2值分別為（331.5±18.3）ms、（219.5±21.8）ms、（218.0±17.3）ms、（171.7±32.5）ms。與對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞）比較，經(jīng)納米顆粒轉(zhuǎn)染的兩組細(xì)胞T2信號(hào)明顯降低，而CS@MNPs轉(zhuǎn)染的細(xì)胞信號(hào)較MNPs稍低。

圖5 細(xì)胞MRI結(jié)果。A為純凈水組，B為未標(biāo)志的空白細(xì)胞組（2×105個(gè)/ml），C為標(biāo)志未修飾殼聚糖的MNPs納米顆粒組，D為標(biāo)志靶向探針的細(xì)胞組，E為標(biāo)志CS@MNPs的細(xì)胞組

3 討論

Survivin基因在乳腺癌、肺癌、胃癌和胰腺癌等惡性腫瘤中均呈高表達(dá)，基于Survivin基因在胰腺癌中呈高表達(dá)，而在正常組織和慢性胰腺炎組織中幾乎不表達(dá)[8-10]，Survivin很可能是胰腺癌診斷和治療的一個(gè)理想靶點(diǎn)。有學(xué)者對(duì)磁性納米顆粒標(biāo)志細(xì)胞進(jìn)行研究，并成功進(jìn)行MR成像[11]。未經(jīng)修飾的氧化鐵納米顆粒的穩(wěn)定性及生物相容性差，需對(duì)其表面進(jìn)行功能化修飾，降低細(xì)胞毒性，同時(shí)可以提供連接生物分子或藥物等需要的基團(tuán)，如氨基、羧基。本研究采用CS@MNPs作為成像載體，因?yàn)榈头肿恿繗ぞ厶蔷哂休^好的生物相容性，能提高細(xì)胞對(duì)納米顆粒的內(nèi)吞并，降低未經(jīng)修飾的MNPs對(duì)細(xì)胞的毒性，同時(shí)殼聚糖所攜帶的氨基為連接生物分子提供了必需的基團(tuán)。經(jīng)修飾后的納米顆粒僅約20 nm，適用細(xì)胞成像[12]。此外，殼聚糖表面帶正電荷，能增加與細(xì)胞膜的吸附作用，提高對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率。殼聚糖作為DNA或藥物的載體藥物，可以達(dá)到靶向基因治療或靶向藥物治療的目的[13]。

MTT細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)是衡量藥物對(duì)細(xì)胞毒性作用的常用方法。本研究結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)基中鐵濃度的增加，細(xì)胞的活力呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)，且未修飾的MNPs細(xì)胞的活力明顯低于實(shí)驗(yàn)組，當(dāng)鐵濃度高達(dá)100 μg/ml時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞仍具有較高的活力（40.46%），說(shuō)明CS@MNPs對(duì)細(xì)胞的毒性作用較小。普魯士藍(lán)染色結(jié)果直觀地顯示了納米顆粒在細(xì)胞內(nèi)的分布，胰腺癌細(xì)胞能大量地吞噬納米顆粒，高倍鏡下顯示顆粒分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。MTT和普魯士藍(lán)染色結(jié)果也證明靶向探針以25 μg/ml能較好地標(biāo)記胰腺癌細(xì)胞，幾乎每個(gè)細(xì)胞內(nèi)均能觀察到納米顆粒的分布。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示靶向磁性探針研制成功后，Survivin反義核苷酸通過(guò)化學(xué)鍵可以穩(wěn)定地連接到磁性納米顆粒的表面。隨著合成體系中納米顆粒的比例增大，DNA的遷移速率減慢，在比例大于1︰30時(shí)較為明顯，而對(duì)照組ATPS@MNPs提供的氨基不能牢固地連接Survivin反義核苷酸，故所在泳道未出現(xiàn)亮帶影。經(jīng)探針顆粒和殼聚糖孵育后的細(xì)胞能明顯降低T2WI的信號(hào)。磁性靶向探針作為胰腺癌的特異性MR陰性對(duì)比劑，能較明顯地降低T2弛豫時(shí)間，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)組研究制備的磁性納米顆粒及靶向探針具有較好的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率及生物相容性，但是僅局限于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。有研究成功將DNA質(zhì)粒連接至納米顆粒表面，并實(shí)現(xiàn)動(dòng)物腫瘤熱療的初步研究及MR成像[14]。國(guó)內(nèi)外已有許多將靶向探針用于活體成像并取得初步成功的研究，本課題將繼續(xù)靶向探針用于胰腺癌裸鼠原位模型的研究，觀察磁性靶向探針的活體MR成像情況。

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