許 敏，陳 穎，段素敏，劉麗芳

老鸛草為我國傳統(tǒng)中藥，2010版藥典規(guī)定其正品為牻牛兒苗科植物牻牛兒苗(Erodium stephanianum Willd.)、老鸛草(Geranium wilfordii Maxim.)或野老鸛草(Geranium carolinianum L.)的干燥地上部分，前者習(xí)稱“長嘴老鸛草”，后兩者習(xí)稱“短嘴老鸛草”［1］。其化學(xué)成分以鞣質(zhì)、黃酮類最為豐富［2］，是其重要的藥效成分。鞣質(zhì)的藥理活性已遠(yuǎn)不止于收斂固澀，而廣泛應(yīng)用于抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肝病、止血及抗腫瘤等領(lǐng)域［3］。沒食子酸和柯里拉京為老鸛草素的主要分解產(chǎn)物，采用HPLC法對它們進(jìn)行含量測定，并比較了3種不同來源老鸛草藥材中這2種成分含量的差異，為老鸛草藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定和進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1200 HPLC Series液相色譜儀(Agilent公司，美國);(150 mm ×4.6 mm，5 μm)(Dikma公司，美國);BS124S萬分之一分析天平(Sartorius);LD24型高速中藥粉碎機(jī) (浙江省溫嶺市大海藥材器械廠);沒食子酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110831－200302);柯里拉京對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:111623－200301);老鸛草(Geranium wilfordii Maxim.)(采于吉林省通化市東昌區(qū)玉皇山)，牻牛兒苗(Erodium stephanianum Willd.)(采于山東濰坊)，野老鸛草(Geranium carolinianum L.)(采于中國藥科大學(xué)植物園);乙腈為色譜純(Tedia公司，美國);水為樂百氏純凈水;其他試劑均為分析純。

圖1 樣品的HPLC圖

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗

色譜柱:Diamonsil C18(2)色譜柱(150 mm×4.6 mm，5μm)(迪馬公司，美國);流動相:乙腈 －0.1%磷酸溶液，梯度洗脫(洗脫程序見表1);柱溫:25℃;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:20μL;檢測波長:274 nm;色譜圖見圖1。

表1 洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備

取樣品粉末約0.5 g(過40目篩)，精密稱定，置100 mL圓底燒瓶中，加水25 mL，100℃水浴回流1.5 h，過濾，濾渣再用純凈水25 mL同法提取1次，合并濾液，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加水定容至刻度，搖勻。用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸對照品適量，加50%甲醇制成每1 mL中含0.101 2 mg的溶液;精密稱取柯里拉京對照品適量，加50%甲醇制成每1 mL中含0.126 0 mg的溶液，即得。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.3.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取0.101 2 mg/mL的沒食子酸對照品溶液，用50%甲醇配置成濃度為0.010 12 mg/mL、0.025 3 mg/mL、0.050 6 mg/mL、0.075 9 mg/mL、0.101 2 mg/mL的5種溶液，搖勻，分別進(jìn)樣20μL，用上述色譜條件測定。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，測得的峰面積積分值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程:Y=2 742.5X+29.546，r=0.999 6。表明在0.202 4μg ～2.024 0μg之間有良好的線性關(guān)系。

2.3.2 柯里拉京標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取0.126 0 mg/mL的柯里拉京對照品溶液，用50%甲醇配置成濃度為 0.006 3 mg/mL、0.012 6 mg/mL、0.025 2 mg/mL、0.063 0 mg/mL、0.126 0 mg/mL的5種溶液，搖勻，分別進(jìn)樣20μL，用上述色譜條件測定。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，測得的峰面積積分值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程:Y=1 845.4X － 58.619，r=0.999 2。表明在0.126 0μg ～2.520 0μg之間有良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗

精密吸取等體積的沒食子酸(0.025 3 mg/mL)、柯里拉京(0.025 2 mg/mL)對照品溶液注入液相色譜儀，重復(fù)6次，沒食子酸RSD=1.6%，柯里拉京RSD=4.3%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

精密吸取供試品溶液，分別于 0、3、6、9、12、24 h測定，沒食子酸 RSD=4.8%，柯里拉京 RSD=2.2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗

精密稱取同一樣品6份，按“2.2.1”項方法制備，在“2.1”項條件下測定，沒食子酸含量分別為0.23%、0.22%、0.23%、0.23%、0.23%、0.23%，平均值為0.23%，RSD=1.7%;柯里拉京含量分別為0.23%、0.23%、0.23%、0.23%、0.23%、0.21%，平均值為0.23%，RSD=3.4%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.7 檢測限及定量限

分別將沒食子酸和柯里拉京對照品溶液逐漸稀釋后進(jìn)樣，取S/N=3時的濃度為檢測限，經(jīng)測定，沒食子酸檢測限為0.032μg/mL，柯里拉京檢測限為0.126μg/mL;取S/N=10時的濃度為定量限，經(jīng)測定，沒食子酸定量限為0.063μg/mL，柯里拉京定量限為0.252 μg/mL。

2.8 回收率試驗

精密稱取0.25 g樣品6份，分別加入相當(dāng)于樣品含量100%的兩種對照品，同樣品測定方法提取、制備、計算，結(jié)果見表2，表明本法具有較好的準(zhǔn)確性。

2.9 樣品的含量測定

分別精密稱取老鸛草、野老鸛草、牻牛兒苗粉末約0.5 g，按“2.2.1”項方法處理，分別精密吸取供試品溶液進(jìn)樣20μL，用外標(biāo)法測定含量(n=3)，結(jié)果見表3。

表2 回收率測定結(jié)果

表3 含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 老鸛草素(geraniin)屬于可水解鞣質(zhì)中的鞣花鞣質(zhì)(ellagitannin)，加水分解時分解為沒食子酸，六羥基聯(lián)苯二甲酸，柯里拉京，鞣花酸等［4］。有報道對野老鸛草采用水提［5－6］，實驗發(fā)現(xiàn)水提均可增大3種老鸛草來源中沒食子酸和柯里拉京的含量。

3.2 前期考察了不同提取溶劑:50%甲醇、50%丙酮、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇和水回流提取，結(jié)果證實水提取得到?jīng)]食子酸、柯里拉京總量最多，又比較了不同提取時間(1 h、1.5 h、2 h)和提取次數(shù)(1次、2次、3次)，結(jié)果表明水回流1.5 h提取兩次基本提取完全。

3.3 樣品測定結(jié)果表明，3種來源的老鸛草中沒食子酸和柯里拉京的含量差異較大:老鸛草中沒食子酸和柯里拉京的含量最低，兩者僅為0.2%左右;野老鸛草和牻牛兒苗中沒食子酸的含量均較高，其中牻牛兒苗中最高;牻牛兒苗中柯里拉京的含量是老鸛草的15倍、野老鸛草的2倍。研究表明［7］，柯里拉京具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗炎等廣泛的生物活性，具有很大的藥用價值，市場前景廣闊，已引起國內(nèi)外學(xué)者的重視，本研究結(jié)果對該化合物的進(jìn)一步深入研究和開發(fā)提供了有益的參考。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:113.

［2］ 吳秋月，齊潔，李默影，等.牻牛兒苗的化學(xué)成分研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2012，40(1):76 －78.

［3］ 吳悅濤，金哲雄.老鸛草中鞣質(zhì)類化學(xué)成分及其藥理活性研究進(jìn)展［J］.黑龍江醫(yī)藥，2008，21(1):67 －68.

［4］ 杜曉鳴，郭永泗.老鸛草素及抗氧化作用［J］.國外醫(yī)藥植物藥分冊，1990，5(2):57 －61.

［5］ 金欣，王鋒，姚嵐，等.HPLC測定野老鸛草中沒食子酸和鞣花酸的總量［J］.中成藥，2010，32(7):1172 －1176.

［6］ Wu Qiuyue，Zhou Yang，Jin Xin，et al.Chromatographic Fingerprint and the Simultaneous Determination of Five Bioactive Components of Geranium carolinianum L.Water Extract by High Performance Liquid Chromatography.［J］.Int J Mo Sci，2011，12，8740－8749.

［7］ 陳一燕，陳崇宏.柯里拉京藥理活性研究進(jìn)展［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2010，27(5):390－394.