龍鐘明，王 利，茍小蘭，劉港彪，冀國(guó)幀，韋 璇

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物遺傳育種學(xué)國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041）

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)江團(tuán)研究報(bào)道得較少，主要集中在江團(tuán)池塘養(yǎng)殖和養(yǎng)殖營(yíng)養(yǎng)需求等方面，對(duì)江團(tuán)的細(xì)菌性疾病鮮見(jiàn)報(bào)道。吉氏檸檬酸桿菌為檸檬酸桿菌屬細(xì)菌，革蘭氏陰性，需氧或兼性厭氧。近年來(lái)，國(guó)外研究者已在人及水生動(dòng)物中報(bào)道了吉氏檸檬酸桿菌。國(guó)內(nèi)尚缺乏對(duì)該菌的研究。本文筆者通過(guò)生理生化實(shí)驗(yàn)、16S rDNA序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，對(duì)江團(tuán)吉氏檸檬酸桿菌進(jìn)行了分離鑒定，并進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，旨在為江團(tuán)細(xì)菌性病原的鑒定和防治以及江團(tuán)資源的保護(hù)和利用積累科學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 材料 發(fā)病江團(tuán)來(lái)自四川某養(yǎng)殖場(chǎng)。江團(tuán)體長(zhǎng)7 cm，21g，體表黏液較多，胸鰭、腹鰭基部充血，肛門輕微紅腫。主要試劑：SS瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、生化鑒定藥品和藥敏紙片，均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。TaqMix、DNA MarkerDL2000 等 購(gòu) 自 TIANGEN BIOTECH（BEIJING）公司。

1.2 細(xì)菌的分離和菌落形態(tài)觀察 無(wú)菌操作取江團(tuán)心臟等組織，劃線接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂和SS瓊脂培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)12h。待平板長(zhǎng)出單一菌落后，挑選單個(gè)菌落劃線純化，純化菌株于4℃保存。將純化菌株分別劃線接種到MC、SS、營(yíng)養(yǎng)瓊脂中觀察菌落形態(tài)。

1.3 生理生化鑒定 將純化菌穿刺接種到細(xì)菌生化特性鑒定管中，進(jìn)行H2S、動(dòng)力性、尿酶、檸檬酸鹽利用、糖類等理化特性測(cè)定。根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。

1.4 16S rDNA基因序列分析

1.4.1 基因的擴(kuò)增和測(cè)序 模板制備：取一EP管加入100μL滅菌ddH2O，挑取槍頭大小的經(jīng)過(guò)24h培養(yǎng)的細(xì)菌菌落于滅菌ddH2O中，制成懸液，置-80℃凍存1h后，迅速置入沸水浴中20min，然后12000r/min離心5min，取上清作為細(xì)菌粗提模板，-20℃保存?zhèn)溆?。采用?xì)菌16S rDNA通用引物（正向引物：AGAGTTTGATCCTGGC TTAG，反向引物：ACGGCTACCTTGTTACGACTT）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：上游引物1.0μL，下游引物1.0μL（引物濃度均為 10μmol/L），ddH2O 25μL，2×Taq PCR MasterMix 20 μL，模板 3.0 μL，總體系為 50 μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 4 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 4 min，5 個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 4 min，5 個(gè)循環(huán)；94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 4min，30個(gè)循環(huán)。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將陽(yáng)性樣品送交北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4.2 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 利用Blastn程序?qū)闖T-0603 16S rDNA序列進(jìn)行同源性檢索，找出相似性最高的菌種及同屬菌種作為內(nèi)群，另外選取檸檬酸屬的布氏檸檬酸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌和氣單胞菌屬的維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌等幾種細(xì)菌作為外群。用ClustalX2軟件進(jìn)行多序列全局比對(duì)，利用MEGA5.0軟件，Neighbour-Joining方法，采用Kimura 2-parameter校正模型，自舉1000次構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)采用K-B法，挑取待檢細(xì)菌于少量生理鹽水中制成細(xì)菌混懸液，調(diào)到0.5個(gè)麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)，用滅菌棉拭子將待檢細(xì)菌混懸液均勻涂布于MH瓊脂平板，再貼上藥敏紙片，28℃培養(yǎng)18 h后，觀察并測(cè)量抑菌圈大小。

2 結(jié)果

2.1 菌落形態(tài) 在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上的菌落直徑一般為2～4 mm，光滑、低凸、濕潤(rùn)、半透明或不透明，灰色，表面有光澤，邊緣整齊。革蘭氏陰性，單個(gè)或成對(duì)，直桿菌。

2.2 生化鑒定 該細(xì)菌主要的理化特性為具有動(dòng)力性，不發(fā)酵側(cè)金盞花醇、山梨醇、木糖等；葡磷胨水、蛋白胨水、賴氨酸、尿素、鳥(niǎo)氨酸、苯丙氨酸等呈陰性反應(yīng)；硫化氫、檸檬酸鹽、葡萄糖產(chǎn)氣、葡萄糖酸鹽呈陽(yáng)性反應(yīng)，其生化特性見(jiàn)表1。參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》，初步判斷該菌為吉氏檸檬酸桿菌。

表1 菌株JT-0603生化試驗(yàn)結(jié)果

2.3 16S rDNA序列分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，結(jié)果見(jiàn)圖1。經(jīng)測(cè)序分析，16S rDNA序列片段大小為1 446 bp，將此序列提交至 GenBank，收錄號(hào)為JN571748。測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析顯示，該細(xì)菌的16S rDNA與GenBank中吉氏檸檬酸桿菌不同分離株的相似性最高達(dá)97%。選取相似度較高的菌株及相關(guān)菌株運(yùn)用ClustalX2、MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。分離菌株（圖中以“◆”標(biāo)記）與吉氏檸檬酸桿菌DQ23881.1、吉氏檸檬酸桿菌NR041697.1等聚為一簇，且Bootstrap檢驗(yàn)值達(dá)67，可以初步確定該菌株為吉氏檸檬酸桿菌。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 藥敏試驗(yàn)表明，菌株JT-0603對(duì)環(huán)丙沙星、磺胺異惡唑、痢特靈、氟哌酸、鏈霉素、氟苯尼考、恩諾沙星等藥物高度敏感；對(duì)強(qiáng)力霉素、氨芐青霉素低度敏感；對(duì)紅霉素耐藥。結(jié)果詳見(jiàn)表2。

圖1 16S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 菌株JT-0603 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

表2 菌株JT-0603藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 分析及結(jié)論

3.1 Brenner等對(duì)112株檸檬酸桿菌進(jìn)行了DNA雜交試驗(yàn)，并進(jìn)行了分類，其中除吉氏檸檬酸桿菌外，還包含有弗氏檸檬酸桿菌、科氏檸檬酸桿菌、法氏檸檬酸桿菌等11個(gè)基因種。對(duì)于多數(shù)檸檬酸桿菌株而言，檸檬酸鹽可作為唯一碳來(lái)源。弗氏檸檬酸桿菌是以檸檬酸鹽為唯一碳源，但是一些吉氏檸檬酸桿菌卻不能利用檸檬酸鹽，JT-0603菌株表現(xiàn)為陽(yáng)性。賴氨酸不能被脫羧基。鳥(niǎo)氨酸能被布氏檸檬酸、法式檸檬酸等利用，但是不能被吉氏檸檬酸等脫羧基化。檸檬酸屬只有柯氏檸檬酸才發(fā)酵側(cè)金盞花醇。弗氏、布氏和楊氏檸檬酸桿菌等能在加有硫化氫的克氏雙糖鐵瓊脂和三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而菌株JT-0603也表現(xiàn)為陽(yáng)性。右旋葡萄糖能被大部分的檸檬酸桿菌用來(lái)產(chǎn)酸產(chǎn)氣。本試驗(yàn)菌株JT-0603的生理生化特性基本符合吉氏檸檬酸桿菌的特性。

3.2 16SrRNA為核糖體RNA的一個(gè)亞基，而16SrDNA是編碼該亞基的基因。16S rDNA普遍存在于各種細(xì)菌中。16S rDNA由保守區(qū)和可變區(qū)交錯(cuò)排列組成。保守區(qū)為所有細(xì)菌所共用，而可變區(qū)可以用來(lái)區(qū)分不同的細(xì)菌。由于16S rDNA具有保守區(qū)和特異區(qū)并存的特點(diǎn)，使其在病原菌的臨床檢測(cè)中具有篩選和鑒別的雙重作用。用此方法已鑒定出弗氏檸檬酸桿菌、賽氏檸檬酸桿菌。本試驗(yàn)通過(guò)16S rDNA基因序列分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，證明了菌株JT-0603為吉氏檸檬酸桿菌，從而也印證了16S rDNA基因分析是進(jìn)行細(xì)菌鑒定的有效方法。

3.3 本研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株JT-0603僅對(duì)紅霉素耐藥。紅霉素是國(guó)家禁用藥物，應(yīng)嚴(yán)格禁止濫用，也可能是該菌具有紅霉素的抗性基因。本菌株對(duì)氨芐青霉素、強(qiáng)力霉素等臨床上常用的抗生素低度敏感，這可能與養(yǎng)殖戶過(guò)度使用這些抗生素有關(guān)。在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中，要慎重使用抗生素，防止細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生與加重，避免濫用藥物對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境造成污染。而一旦發(fā)生疾病，應(yīng)及時(shí)診斷，使用國(guó)家允許的漁用藥物治療。如果鑒定出吉氏檸檬酸桿菌為病原菌，可以根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，采用敏感性藥物進(jìn)行治療，從而減少疾病造成的損失。

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