孟麗軍 ，楊曉玲 ，江文明 ，李云祝 ，孟坤武 ，胡安都

（1.四川省大竹縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 大竹 635100；2.四川省大竹縣畜牧食品局，四川 大竹 635100）

近年來，有很多地區(qū)針對豬瘟、豬口蹄疫、高致病性藍(lán)耳病這3種疫苗的免疫程序及聯(lián)合免疫效果進(jìn)行了研究，各研究結(jié)果不盡一致。近期，四川大竹縣高致病性藍(lán)耳病的免疫抗體效價(jià)較低，是與同時(shí)注射不同疫苗有關(guān)，還是與先后注射不同疫苗的順序有關(guān)，尚缺乏試驗(yàn)檢測的數(shù)據(jù)。為了準(zhǔn)確評估3種疫苗聯(lián)合免疫后的效果及安全性，降低基層免疫工作強(qiáng)度和提高豬群的免疫抗體水平，本研究針對四川省大竹縣本地情況就3種疫苗的免疫程序進(jìn)行研究，以優(yōu)化該縣的免疫程序。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 選取大竹縣竹北鄉(xiāng)某豬場40～50日齡未經(jīng)任何疫苗免疫的仔豬133頭作為試驗(yàn)豬，免疫前對試驗(yàn)豬進(jìn)行3種病毒（豬瘟、口蹄疫、藍(lán)耳病）的基礎(chǔ)抗體滴度測定，得出：高致病性藍(lán)耳病病毒抗體陰性，口蹄疫感染抗體陰性，豬瘟感染抗體陰性。3種病毒的免疫抗體滴度均低于1∶16，適合作為試驗(yàn)對象。

1.2 試驗(yàn)疫苗 豬O型口蹄疫滅活苗，生產(chǎn)批號：A110104J，生產(chǎn)廠家：中農(nóng)威特生物科技股份有限公司。政府采購豬瘟活疫苗（傳代細(xì)胞苗），生產(chǎn)批號：1030，生產(chǎn)廠家：廣東永順生物制藥有限公司。高致病性藍(lán)耳病滅活苗，生產(chǎn)批號：201012003，生產(chǎn)廠家：北京信得威特科技有限公司。

1.3 檢測試劑及檢測卡 檢測豬瘟、O型口蹄疫及高致病性藍(lán)耳病的抗體試劑盒和抗體快速金標(biāo)檢測卡均購自深圳市某生物科技有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器及器械 高速臺式離心機(jī)TGL-16B，微量振蕩器ZW-A，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9070，酶標(biāo)儀DNM-9602，單道/多道各種量程移液器，優(yōu)普超純水機(jī)UPT-II-5T，冰柜BCD-208；20mL金屬注射器，0.9號的獸用采血器，豬保定器，記號筆等。

1.5 試驗(yàn)場地與飼養(yǎng)管理要求 試驗(yàn)地設(shè)在大竹縣竹北鄉(xiāng)某豬場，附近無其他豬舍，各組單獨(dú)一圈，隔離飼養(yǎng)，飼喂相同飼料，整個(gè)試驗(yàn)場地封閉管理，固定飼養(yǎng)人員，嚴(yán)格消毒，杜絕無關(guān)人員出入。

1.6 試驗(yàn)分組 將133頭仔豬隨機(jī)分成7組：第1組18頭，注射豬O型口蹄疫滅活苗；第2組19頭，注射豬瘟活疫苗；第3組19頭，注射高致病性藍(lán)耳病滅活苗；第4組19頭，同時(shí)分點(diǎn)注射O型口蹄疫和豬瘟疫苗，間隔7d后再注射高致病性藍(lán)耳病疫苗；第5組19頭，同時(shí)分點(diǎn)注射口蹄疫和高致病性藍(lán)耳病疫苗，間隔7d后再注射豬瘟疫苗；第6組19頭，同時(shí)分點(diǎn)注射高致病性藍(lán)耳病和豬瘟疫苗，間隔7d后再注射口蹄疫疫苗；第7組20頭，同時(shí)分點(diǎn)注射口蹄疫、豬瘟及高致病性藍(lán)耳病疫苗。

1.7 免疫方法和部位 單種疫苗免疫，注射部位為左右頸部。2種疫苗和3種疫苗同時(shí)分點(diǎn)免疫，注射部位為左右頸部和腿部內(nèi)側(cè)。免疫有效劑量：口蹄疫疫苗1 mL、豬瘟疫苗1頭份、高致病性豬藍(lán)耳病滅活苗2mL。

1.8 臨床不良反應(yīng)觀察 所有試驗(yàn)豬在免疫注射后臨床觀察7～10d，主要觀察豬只精神狀況是否良好，采食是否正常，體溫有無升高，是否有其他嚴(yán)重不良反應(yīng)，對異常的豬要作詳細(xì)記錄。

1.9 免疫抗體檢測 免疫后的14、21、28、35 d和42 d經(jīng)前腔靜脈采血，分離血清。采用間接ELISA法進(jìn)行豬瘟、O型口蹄疫、高致病性藍(lán)耳病IgG抗體的間接ELISA測定，具體操作步驟依照試劑盒說明進(jìn)行。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 樣品使用酶標(biāo)儀于波長450 nm（630nm作為參比波長）下測定其吸光度（OD值），所得數(shù)據(jù)用SPSS10.0軟件的One-Way ANVOA方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.11 田間試驗(yàn) 在以上3種疫苗同時(shí)分點(diǎn)免疫取得較好免疫效果和抗體合格率達(dá)標(biāo)的情況下，隨后在大竹縣清河、永勝、歐家、李家、高穴等5個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的多個(gè)散戶或者豬場進(jìn)行田間試驗(yàn)，并且在一免、二免、三免后用抗體快速金標(biāo)檢測卡檢測其抗體合格率。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫副反應(yīng) 對試驗(yàn)豬免疫后96 h內(nèi)的精神、采食、體溫變化等免疫副反應(yīng)情況進(jìn)行逐頭觀察和記錄。試驗(yàn)組1～6組（單免對照組及兩種疫苗聯(lián)合免疫組）免疫豬113頭，除第3組死亡1頭外，未出現(xiàn)精神不振、食欲下降、體溫升高等免疫副反應(yīng)情況，未出現(xiàn)死亡情況。試驗(yàn)7組免疫豬20頭，有1頭出現(xiàn)呼吸急促、精神不振、食欲下降、體溫偏高等一般免疫副反應(yīng)，免疫副反應(yīng)率為5%。

2.2 不同免疫程序口蹄疫抗體的產(chǎn)生情況 從表1和圖1可看出，各組抗體水平都在35d達(dá)到了最高值，且維持時(shí)間較長，在42d的時(shí)候還處于比較高的抗體水平。第5、7組抗體水平要稍高于其他組（P＜0.05），口蹄疫和藍(lán)耳病結(jié)合分點(diǎn)注射，其中包括3種疫苗聯(lián)合，對口蹄疫抗體水平的提高起到了促進(jìn)作用。而其他組合對口蹄疫的抗體效價(jià)沒有較大的影響，和對照組單免口蹄疫的抗體水平保持一致。

表1 免疫豬口蹄疫血清IgG抗體間接ELISA檢測（xˉ±s）

圖1 免疫豬口蹄疫血清IgG抗體效價(jià)變化圖

2.3 不同免疫程序高致病性藍(lán)耳病抗體的產(chǎn)生情況

從表2和圖2可以看出，高致病性藍(lán)耳病抗體在免疫后35d達(dá)到較高的抗體水平，但是和豬瘟、口蹄疫抗體的OD值相比仍較低。第5組的抗體水平要高于其他組（P＜0.05），比單獨(dú)注射藍(lán)耳病疫苗的陽性率高，說明藍(lán)耳病疫苗及豬口蹄疫疫苗分點(diǎn)同時(shí)注射對藍(lán)耳病疫苗有效抗體的產(chǎn)生有積極的協(xié)同作用，并促進(jìn)藍(lán)耳病抗體的產(chǎn)生。第6組的抗體水平明顯低于其他組（P＜0.05），說明豬瘟疫苗和高致病性藍(lán)耳病疫苗同時(shí)分點(diǎn)注射對藍(lán)耳病抗體的產(chǎn)生有一定的干擾作用。

表2 免疫豬藍(lán)耳病血清IgG抗體間接ELISA檢測（xˉ±s）

圖2 免疫豬藍(lán)耳病血清IgG抗體效價(jià)變化圖

2.4 不同免疫程序豬瘟抗體的產(chǎn)生情況 從表3和圖3可以看出，豬瘟抗體在免疫后的28d達(dá)到最高抗體水平，之后開始下降。第4、5組抗體水平和第2組對照組沒有明顯的差別（P＞0.05），說明豬瘟和口蹄疫聯(lián)合分點(diǎn)注射沒有互相干擾。第6、7組抗體水平較低，使豬瘟免疫抗體水平最高值推遲到接種后35d，說明藍(lán)耳病疫苗及豬瘟疫苗分點(diǎn)同時(shí)注射對豬瘟有效抗體的產(chǎn)生有干擾作用，并推遲豬瘟免疫抗體水平的升高。

2.5 不同免疫程序在免疫后35d的抗體合格率 采用ELISA方法，具體操作參照試劑盒說明書進(jìn)行。判定標(biāo)準(zhǔn)：待檢血清450 nm（630 nm作參比波長）處的吸光值（OD值）大于陰性對照A值平均值的2.1倍，即判為陽性；如陰性對照孔OD值的平均值低于0.08時(shí)，則按照0.08計(jì)算。

表3 免疫豬豬瘟IgG抗體間接ELISA檢測（xˉ±s）

圖3 不同免疫程序豬瘟抗體變化圖

從各組的合格率結(jié)果分析（見表4），每組的合格率達(dá)到了國家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，豬瘟和口蹄疫都達(dá)到了較高的合格率，相比之下高致病性藍(lán)耳病抗體的合格率較低。從合格率看，第7組3種疫苗同時(shí)分點(diǎn)免疫達(dá)到了國家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，并且和單獨(dú)免疫及分兩次免疫相比，合格率沒有很大的差異。

表4 免疫后35d不同抗體的合格率

2.6 3種疫苗同時(shí)分點(diǎn)免疫（田間試驗(yàn)）的抗體合格率及免疫副反應(yīng)情況 田間試驗(yàn)的試驗(yàn)豬共592頭，全都按照3種疫苗同時(shí)分點(diǎn)注射的方式進(jìn)行。其中有3頭出現(xiàn)了免疫副反應(yīng)。在免疫后用抗體快速金標(biāo)檢測卡進(jìn)行檢測，其中對107頭進(jìn)行首免后30d檢測；對102頭進(jìn)行二免后30d檢測；對383頭進(jìn)行三免后30d檢測。檢測方法按照說明書進(jìn)行，用肉眼觀察檢測線和對照線的差別。檢測線顏色越深，抗體滴度越高，如果檢測線顏色很淺，比對照卡中1∶16顏色都還淺的時(shí)候說明抗體滴度不合格。

從圖4可以看出，首次免疫的檢測線顏色較淺，二免和三免的檢測線顏色逐步加深，說明抗體滴度隨著免疫次數(shù)的增多而增強(qiáng)。從表5可以看出，抗體合格率都達(dá)到了國家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，豬瘟和口蹄疫呈高位態(tài)勢。

3 討論

3.1 豬瘟活疫苗和高致病性藍(lán)耳病活疫苗的應(yīng)用 本次研究，豬瘟活疫苗采用了1頭份劑量對仔豬進(jìn)行了免疫，從結(jié)果可以看出，不同方式的免疫接種，其平均豬瘟抗體OD值均在28～35d達(dá)到合格水平。而當(dāng)前在大竹縣實(shí)際生產(chǎn)中，不少散戶自行進(jìn)行多頭份免疫，這種做法在實(shí)際生產(chǎn)中必要性不大。目前國內(nèi)不少學(xué)者均持有相同觀點(diǎn)。7個(gè)組高致病性藍(lán)耳病的抗體水平都低于豬瘟和口蹄疫的抗體水平，說明高致病性藍(lán)耳病活疫苗免疫一次的效果不是很好，必須要經(jīng)過加強(qiáng)免疫才能達(dá)到較高的抗體水平。這與冉智光等得出的結(jié)論相似。

圖4 3種疫苗聯(lián)合分點(diǎn)免疫（田間試驗(yàn)）不同免疫次數(shù)的金標(biāo)檢測卡所顯示的抗體滴度

表5 3種疫苗聯(lián)合分點(diǎn)免疫（田間試驗(yàn)）的抗體合格率

3.2 兩種疫苗同時(shí)分點(diǎn)免疫 豬瘟和藍(lán)耳病疫苗同時(shí)分點(diǎn)免疫時(shí)，豬瘟抗體效價(jià)的產(chǎn)生出現(xiàn)了抑制和推遲，而在同時(shí)分點(diǎn)免疫的7d后又免疫口蹄疫苗，結(jié)果口蹄疫抗體值相對其他方式有所降低，高致病性藍(lán)耳病的抗體水平也受到了影響，華樹明、羅冬生等也得出了相同的研究結(jié)論，故這種免疫組合方式在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)盡量規(guī)避。同時(shí)分點(diǎn)免疫口蹄疫和藍(lán)耳病，結(jié)果藍(lán)耳病和口蹄疫的抗體值相對其他組增高，證明該兩種疫苗在進(jìn)行同時(shí)分點(diǎn)免疫時(shí)，具有明顯的協(xié)同促進(jìn)效應(yīng)，這與當(dāng)前多家類似研究的結(jié)果一致。在7d后免疫豬瘟，其抗體值和產(chǎn)生時(shí)間均不受影響。因此，根據(jù)本次試驗(yàn)的研究結(jié)果，大竹縣豬場可采用第5組免疫方案。

3.3 3種疫苗同時(shí)分點(diǎn)免疫 3種疫苗同時(shí)分點(diǎn)免疫在實(shí)際生產(chǎn)中具有節(jié)省人工，降低生物安全風(fēng)險(xiǎn)，減少多次免疫所產(chǎn)生的應(yīng)激等優(yōu)勢。本研究將豬瘟、豬口蹄疫、豬高致病性藍(lán)耳病3種疫苗同時(shí)分點(diǎn)免疫時(shí)，表現(xiàn)出5%的免疫副反應(yīng)。這與馬睿麟等的研究結(jié)果存在差異，可能與本次試驗(yàn)對象的個(gè)體差異及群體數(shù)目相對較小有關(guān)。田間試驗(yàn)的試驗(yàn)豬共592頭，有3頭出現(xiàn)了免疫副反應(yīng)，表現(xiàn)出0.5%的免疫副反應(yīng)，但還在免疫反應(yīng)的正常范圍內(nèi)（2%～0.05%）?？偟恼f來，3種疫苗同時(shí)分點(diǎn)免疫的免疫副反應(yīng)和單獨(dú)免疫及兩兩結(jié)合免疫的免疫副反應(yīng)沒有明顯的差別。

3.4 免疫次數(shù)和抗體效價(jià)的關(guān)系 從田間試驗(yàn)3種疫苗同時(shí)分點(diǎn)免疫各次免疫的抗體效價(jià)測定結(jié)果看，免疫次數(shù)和抗體效價(jià)成正比關(guān)系，加強(qiáng)免疫的抗體滴度明顯高于首免的抗體滴度，所以通過加強(qiáng)免疫可以提高抗體的滴度，提高免疫保護(hù)力。

4 結(jié)論

通過豬場試驗(yàn)和田間試驗(yàn)對抗體滴度的測定以及抗體合格率的統(tǒng)計(jì)表明，3種疫苗同時(shí)分點(diǎn)免疫的抗體滴度維持在較高水平，抗體合格率都達(dá)到了國家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，所以在保證安全性和提高免疫效果的前提下，為節(jié)省人力、財(cái)力，以及減少多次免疫引發(fā)的豬應(yīng)激反應(yīng)，特別是在散養(yǎng)戶和小型養(yǎng)豬場，可以推廣3種疫苗同時(shí)分點(diǎn)注射的免疫方式，以此辦法進(jìn)行試點(diǎn)推廣，推廣結(jié)果有待我中心進(jìn)一步作跟蹤研究。

致謝：本試驗(yàn)得到了大竹縣畜牧食品局的大力支持和大竹縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心所有同志們的大力協(xié)助；另外，也得到了大竹縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所陳明、趙朝霞、李永川、王博等的大力幫助，在此一并致謝！

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