劉佳欣，文 震，涂志紅，何 靜，王春梅

（深圳大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院食品科學(xué)與工程系，廣東深圳518060）

白黎蘆醇（Resveratrol，Res）是一種二苯乙烯類化合物，化學(xué)名為3，4’，5-三羥基二苯乙烯（3，4’，5-trihydroxystilbene）（見圖1）。白藜蘆醇具有抗氧化、抗菌消炎、調(diào)節(jié)血脂、抑制腫瘤的作用，在健康食品的研究與開發(fā)中具有良好的應(yīng)用前景[1-2]。白藜蘆醇主要存在于葡萄、虎杖、藜蘆、決明子和花生等天然植物及其加工制品中，尤其在紅葡萄酒中含量較高[3-4]。近年來(lái)，白藜蘆醇已成為紅酒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)之一，快速、靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)紅酒中白黎蘆醇含量，對(duì)紅酒生產(chǎn)工藝、保存條件的控制和營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)具有重要意義[5-6]。目前白藜蘆醇的分析方法主要有紫外分光光度法、熒光分光光度法、HPLC法、RP-HPLC法、GC法等[7]。紫外分光光度法操作簡(jiǎn)單，但干擾明顯，誤差大[8]。HPLC法結(jié)果準(zhǔn)確，但步驟繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)[9]。GC法需對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理，前處理比較復(fù)雜[10]。熒光分光光度分析白藜蘆醇具有操作簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果精確的特點(diǎn)[11]，但傳統(tǒng)的二維熒光光譜并不能完整描述物質(zhì)的熒光特性[12]。三維熒光光譜能夠獲得物質(zhì)在激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)同時(shí)改變的情況下的熒光強(qiáng)度，較完整表達(dá)研究物質(zhì)的光譜信息[13]。作為一種新型熒光分析技術(shù)，三維熒光光譜法應(yīng)用于白藜蘆醇分析尚未見報(bào)道。本文研究了白藜蘆醇的三維熒光光譜特性，并以此檢測(cè)紅酒中白藜蘆醇的含量，樣品不需前處理，方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、選擇性好、且不破壞樣品，為紅酒中白藜蘆醇的直接與快速分析提供了一種新方法。

圖1 白藜蘆醇分子式與結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular formula and structure of resveratrol

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白藜蘆醇對(duì)照品 純度＞99%，德國(guó)Sigma公司；無(wú)水乙醇 優(yōu)級(jí)純，廣州化學(xué)試劑廠；對(duì)照紅酒 深圳市食品科技協(xié)會(huì)提供；紅酒樣品 市售。

RF-5000型熒光光譜儀 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液 取白藜蘆醇對(duì)照品100mg，用無(wú)水乙醇配制成0.1mg/mL溶液，儲(chǔ)于棕色容量瓶中備用。分別移取白藜蘆醇儲(chǔ)備溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL置于6個(gè)25mL棕色容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度，其中白藜蘆醇的濃度為0～2mg/L。搖勻，靜置30min，待測(cè)。

1.2.2 紅酒樣品溶液的配制 取市售干紅葡萄酒樣品1mL，用無(wú)水乙醇稀釋10倍，待用搖勻，靜置40min，待測(cè)。

1.2.3 樣品光譜特性 將白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液與紅酒待測(cè)液置于比色皿中，放置在熒光光譜儀中測(cè)定。儀器參數(shù)設(shè)置如下：激發(fā)波長(zhǎng)（λex）為250～350nm，每間隔3nm讀取一個(gè)數(shù)據(jù)；發(fā)射波長(zhǎng)（λem）為300～500nm，每間隔3nm讀取一個(gè)數(shù)據(jù)。激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為5nm，掃描速度為1200nm·min-1，PMT電壓為700V，響應(yīng)時(shí)間為自動(dòng)，掃描光譜進(jìn)行儀器自動(dòng)校正。繪制三維填充熒光光譜圖，研究白藜蘆醇及紅酒的三維熒光光譜特性，確定最大激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)。

1.2.4 樣品測(cè)定 在最大激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)處分別測(cè)定白藜蘆醇對(duì)照品與紅酒樣品的熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度對(duì)相應(yīng)的濃度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算紅酒中白藜蘆醇的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇熒光特征

對(duì)白藜蘆醇對(duì)照品與對(duì)照紅酒的激發(fā)與發(fā)射光譜進(jìn)行掃描，將熒光強(qiáng)度的數(shù)據(jù)用矩陣形式表示，行和列分別對(duì)應(yīng)不同的激發(fā)光波長(zhǎng)λex和發(fā)射光波長(zhǎng)λem，每個(gè)矩陣元素表示在波長(zhǎng)為λex的激發(fā)光激發(fā)下發(fā)射波長(zhǎng)為λem的熒光強(qiáng)度，建立激發(fā)-發(fā)射矩陣，繪制等角三維投影熒光光譜圖，結(jié)果如圖2與圖3所示。

圖2 白藜蘆醇等角三維投影熒光光譜圖Fig.2 Isometric three-dimensional fluorescence spectrometry projection of resveratrol

圖3 對(duì)照紅酒等角三維投影熒光光譜圖Fig.3 Isometric three-dimensional fluorescence spectrometry projection of reference red wine

傳統(tǒng)的熒光光譜只是在一定激發(fā)或發(fā)射波長(zhǎng)下進(jìn)行掃描，得到激發(fā)或發(fā)射波長(zhǎng)與熒光強(qiáng)度的二維譜圖，但是實(shí)際上物質(zhì)產(chǎn)生的熒光是激發(fā)光和發(fā)射光共同作用的結(jié)果，因此傳統(tǒng)的二維熒光光譜并不能完整地描述物質(zhì)的熒光特性[12]。三維熒光描述了熒光強(qiáng)度同時(shí)隨激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)變化的關(guān)系，因此能完整地描述白藜蘆醇的熒光特征，并能提高對(duì)其有效熒光信息的確認(rèn)與提取[14]。白藜蘆醇是非黃酮多酚類化合物（見圖1），其分子結(jié)構(gòu)含有共軛雙鍵體系，呈剛性平面結(jié)構(gòu)，吸光后產(chǎn)生π→π1*躍遷，顯示明顯的熒光特性。苯環(huán)上的酚羥基是給電子取代基，共享了共軛π電子結(jié)構(gòu)，同時(shí)擴(kuò)大了白藜蘆醇分子骨架的共軛雙鍵體系，提高了熒光效率。同時(shí)酚羥基助色團(tuán)的存在，使得熒光光譜的波長(zhǎng)向長(zhǎng)波方向移動(dòng)。熒光光譜掃描表明，白藜蘆醇具有單一的熒光特征發(fā)射峰，最大激發(fā)波長(zhǎng)在290nm處，最大發(fā)射波長(zhǎng)為380nm。而紅酒由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有多個(gè)熒光特征發(fā)射峰，但在λex（290nm）與λem（380nm）處，其特征發(fā)射峰周圍無(wú)其他熒光峰干擾，避免了物質(zhì)間熒光譜的混疊現(xiàn)象，這說(shuō)明紅酒中的白藜蘆醇三維熒光光譜具有指紋特性，在紅酒這一多組分的混合體系分析中發(fā)揮了優(yōu)勢(shì)，為白藜蘆醇的定性與定量分析提供了依據(jù)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法檢出限

分別測(cè)定濃度為0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg/L的白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)溶液在λex（290nm）與λem（380nm）處的熒光強(qiáng)度，對(duì)熒光強(qiáng)度/濃度進(jìn)行線性擬合。在0～2.0mg/L的范圍內(nèi)白藜蘆醇濃度與熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)性，線性回歸方程為Y=2472.9X+290.34，相關(guān)系數(shù)R2=0.9984。

根據(jù)IUPAC檢出限定義式，平行測(cè)定11次空白液的熒光強(qiáng)度。經(jīng)檢出限3σ/N計(jì)算，三維熒光法測(cè)定的白藜蘆醇檢出限為2.57×10-6mg/L，表明該方法具有較好的靈敏度。

2.3 樣品測(cè)定及回收率實(shí)驗(yàn)

按上述所設(shè)條件和實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)紅葡萄酒樣品溶液平行測(cè)定3次，結(jié)果見表1。

在紅酒樣品溶液中加入白藜蘆醇標(biāo)樣，測(cè)定加標(biāo)樣品的熒光強(qiáng)度，并利用線性回歸方程得出加標(biāo)后溶液濃度，計(jì)算樣品的加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。表2結(jié)果表明，樣品測(cè)定的加標(biāo)回收率在95.18%～100.76%之間，RSD為2.96%，表明方法準(zhǔn)確度高，精密度好，檢測(cè)結(jié)果可靠。

表1 對(duì)照紅酒中白藜蘆醇含量的測(cè)定結(jié)果Table 1 The contents of resveratrol in reference red wine

表2 紅酒樣品加標(biāo)回收率Table 2 Recoveries of resveratrol in red wine

2.4 市售紅酒樣品中白藜蘆醇含量測(cè)定

按所建方法分析市售的編號(hào)為1～6的干紅葡萄酒與7～10的紅葡萄酒，分析結(jié)果見表3。

表3 市售紅酒中白藜蘆醇含量Table 3 The contents of resveratrol in commercial red wine

由于各葡萄酒廠選用的葡萄原料的品種、生長(zhǎng)地以及成熟季節(jié)存在差異，加上釀造工藝和保存條件的不同，所以即使是同一類型的葡萄酒其中的白藜蘆醇含量也不盡相同[5]。結(jié)果顯示，干紅葡萄酒的白藜蘆醇含量明顯高于紅葡萄酒，干紅中白藜蘆醇含量一般在0.5～2mg/L之間，部分干紅與葡萄酒白藜蘆醇含量較低，甚至不能檢出白藜蘆醇的存在。這表明，將白藜蘆醇作為紅酒的質(zhì)量指標(biāo)是可行的，三維熒光分析方法為實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)紅酒的生產(chǎn)和存儲(chǔ)提供了一種準(zhǔn)確、迅速且低成本的方法。

3 結(jié)論

3.1 獲取了白藜蘆醇對(duì)照品與紅酒的較為完整的三維熒光光譜，確定白藜蘆醇的最大激發(fā)波長(zhǎng)λex為290nm、發(fā)射波長(zhǎng)λem為380nm。在此λex/λem處，紅酒顯示明確的熒光特征峰，為快速測(cè)定紅酒中白藜蘆醇的含量創(chuàng)造了條件。

3.2 利用三維熒光光譜測(cè)定紅酒中白藜蘆醇，線性回歸方程為Y=2472.9X+290.84，相關(guān)系數(shù)R2=0.9984，檢出限為2.57×10-6mg/L，樣品的加標(biāo)回收率在95.18%～100.76%之間。方法操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，精密度好，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可廣泛應(yīng)用于各系列紅酒中白藜蘆醇的快速檢測(cè)與質(zhì)量控制中。

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