殷 軍，葛 青，毛建衛(wèi)，*，方 晟

（1.浙江理工大學(xué)理學(xué)院，浙江杭州 310018；2.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江杭州310023；3.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310023；4.紹興文理學(xué)院元培學(xué)院，生命科學(xué)系，浙江紹興 312000）

近年來(lái)，人們圍繞竹類(lèi)主要化學(xué)成分的分析及其開(kāi)發(fā)利用開(kāi)展了大量的研究工作。研究表明，竹葉中含有黃酮及其苷類(lèi)、活性多糖類(lèi)、特種氨基酸及其衍生物、葉綠素及一些具有揮發(fā)性成分的化合物。竹葉提取物不僅具有良好的防腐性能和抗氧化性能，而且還具有醫(yī)療、生理保健功能，是一種十分理想的天然綠色食品及化妝品添加劑[1]。竹葉中的多糖是除黃酮之外的另一種重要的生理活性物質(zhì)[2]，國(guó)內(nèi)對(duì)竹葉多糖的提取優(yōu)化研究比較多，但對(duì)竹葉多糖的組分及抗氧化活性研究比較少。研究對(duì)竹葉多糖的組分及抗氧化活性進(jìn)行了研究，旨為竹葉多糖的進(jìn)一步研究利用奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為竹葉資源的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

毛竹葉 采自浙江科技學(xué)院后山，60℃烘干，粉碎備用；試劑 二苯基苦基苯肼（DPPH）、氮藍(lán)四唑（NBT）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、吩嗪硫酸甲酯（PMS）、鐵氰化鉀、三氟乙酸；透析袋；單糖標(biāo)準(zhǔn)品 鼠李糖、木糖、巖藻糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、D-葡萄糖醛酸 均為Sigma公司產(chǎn)品；其余試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

精密電子天平 上海第二分析儀器廠；FD-1冷凍干燥機(jī) 北京德天佑科技發(fā)展有限公司；100B數(shù)顯定時(shí)蠕動(dòng)泵 上海荀甫滬西儀器廠；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本日立公司；800B臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠制；DEAE Sepharose FF、Sephcryl S-100 GE healthcare Bio-Sciences AB。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 竹葉多糖的提取及純化[3]將預(yù)處理好的竹葉置于大燒杯中，加入1∶30的蒸餾水煮沸2h，然后減壓濃縮。提取液中加入3倍體積的無(wú)水乙醇，搖勻后放置冰箱24h，在4000r/min下離心10min，取沉淀。沉淀溶于水，用Sevag法脫蛋白后，加入無(wú)水乙醇至濃度30%，搖勻后放置冰箱24h，離心取沉淀，冷凍干燥得粗多糖BLP30。

取粗多糖BLP30溶于蒸餾水中，配制成20mg/mL的溶液，5000r/min離心15min，取上清液用DEAESepharose Fast Flow離子柱層析（2.6cm×40cm）進(jìn)行初步分離，上樣量為20mL。首先以蒸餾水洗脫，再用0.1、0.2、0.4、0.6、2mol/L的NaCl進(jìn)行梯度洗脫，自動(dòng)部分收集儀分步收集流分，洗脫液每10mL收集一管，苯酚-硫酸法檢測(cè)，根據(jù)糖顯色反應(yīng)結(jié)果合并相同流分。將0.1mol/L NaCl洗脫液，濃縮、反復(fù)透析，冷凍干燥得BLP30。

采用AKTA explorer層析系統(tǒng)，Sephacryl S-100凝膠柱層析對(duì)樣品進(jìn)行純化。洗脫條件：凝膠柱Sephacryl S-100（2cm×55cm）；洗脫液：蒸餾水；流速：1mL/min；樣品濃度：10mg/mL，上樣體積1mL；洗脫液以5mL/管收集，苯酚-硫酸法檢測(cè)，以吸光度對(duì)洗脫體積作圖。

1.2.2 分子量的測(cè)定 分子量的測(cè)定采用尺寸排除色譜和激光光散射聯(lián)用儀（SEC-LLS）。泵的型號(hào)為：Waters-1515（Waters China.Ltd.，USA），柱子型號(hào)為：ultrahydrogel250（7.8mm×300mm）和ultrahydrogel 1000（7.8mm×300mm），柱溫45℃，檢測(cè)器為八角度激光光散射儀（λ=658nm；HELEOS 8，Wyatt Technology Co.，USA）和示差檢測(cè)器（RI-2414），流動(dòng)相為PBS（0.01mol/L，pH7.4），流量為1.0mL/min。檢測(cè)樣品濃度為3.0mg/mL。樣品檢測(cè)前經(jīng)孔徑為0.2μm過(guò)濾器（Whatman，England）過(guò)濾。數(shù)據(jù)處理軟件為ASTRA（Wyatt Technologies）。

1.2.3 單糖組成測(cè)定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)單糖的乙?；痆4-5]精密稱(chēng)取等摩爾（2mmol/L）的巖藻糖、半乳糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露糖，分別溶于3mL蒸餾水中，加入20～30mg硼氫化鈉，于室溫下，間歇振蕩，還原3h，然后用冰醋酸中和過(guò)量的硼氫化鈉，至溶液不再產(chǎn)生氣泡為止，pH應(yīng)在4～5之間，加入3mL甲醇，減壓濃縮蒸干，重復(fù)3～4次，以除去反應(yīng)副產(chǎn)物硼酸及水分，然后置于真空干燥器中過(guò)夜。次日，110℃烘箱中加熱20min，充分除去殘留的水分后，加入4mL醋酐，100℃反應(yīng)1.5h，冷卻，然后加入3mL甲苯，減壓濃縮蒸干，重復(fù)3～4次，以除去多余的醋酐。將乙?；蟮漠a(chǎn)物用4mL氯仿溶解后轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加入少量蒸餾水充分振蕩后，除去上層水溶液，如此重復(fù)4次。氯仿層以適量的無(wú)水硫酸鈉干燥，定容至10mL待GC分析。

1.2.3.2 樣品的乙?；幚?取2mg多糖樣品，放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，加入2mol/L的三氟乙酸（TFA）4mL，在110℃封管水解2h。將水解液低于40℃減壓蒸干，然后加入3mL甲醇蒸干，重復(fù)上述操作4～5次，以完全除去TFA。然后按照1.2.3.1的方法進(jìn)行還原、乙?；?，用氯仿定容至5mL，待GC分析。

1.2.3.3 氣相條件 氣相色譜儀配備HP-5石英毛細(xì)管柱（30m×0.32mm×0.25μm，5%phenyl methylsiloxane），氫火焰離子化檢測(cè)器（FID），高純氮作載氣，柱流量1mL/min。程序升溫：柱初溫120℃，以10℃/min升至240℃，保持6.5min。進(jìn)樣量為0.1μL，分流比1∶30，進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度均為250℃。氫氣35mL/min，空氣350mL/min，尾吹氣30mL/min。

1.2.4 抗氧化活性

1.2.4.1 DPPH自由基清除活性測(cè)定 根據(jù)Espin等[6]的方法進(jìn)行改進(jìn)，測(cè)試了樣品對(duì)DPPH自由基清除活性。

改進(jìn)后方法如下：在4mL濃度為100μmol/L的DPPH甲醇溶液中，加入2mL不同濃度的樣品，徹底搖勻后于室溫下暗處放置1h之后，采用可見(jiàn)光分光光度計(jì)于517nm下測(cè)定吸光度。以蒸餾水作為空白對(duì)照組，維生素C為陽(yáng)性對(duì)照組。樣品的DPPH自由基清除活性（%）的計(jì)算公式為：

1.2.4.2 羥基自由基的清除活性測(cè)定 根據(jù)Cumbes and Smironoff[7]的方法改進(jìn)，在1mL不同濃度的樣品中，分別加入1mL硫酸亞鐵（1.5mmol/L），0.7mL過(guò)氧化氫，0.3mL水楊酸鈉（20mmol/L）?；靹蚝?，在37℃水浴1h，采用可見(jiàn)分光光度在562nm下測(cè)定吸光度。以蒸餾水作為空白對(duì)照組，維生素C為陽(yáng)性對(duì)照組。樣品的羥基自由基的清除活性計(jì)算公式為：

1.2.4.3 超氧自由基的清除活性測(cè)定 根據(jù)Liu and Ng等[8]的方法，進(jìn)行了改進(jìn)。將1mL不同濃度的樣品溶液中按順序加入1mL的氮藍(lán)四唑（NBT，300μmol/L），1mL的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH，936μmol/L），最后加入1mL吩嗪硫酸甲酯（PBS，120mmol/L）啟動(dòng)反應(yīng)。以上溶液均用磷酸緩沖液（100mmol/L，pH7.40）配制。將該混合液混合均勻于室溫下放置5min后，采用可見(jiàn)光分光光度計(jì)于560nm下測(cè)定吸光度。以蒸餾水作為空白對(duì)照組，維生素C為陽(yáng)性對(duì)照組。樣品的超氧陰離子自由基清除活性（%）的計(jì)算公式為：

2 結(jié)果與討論

2.1 竹葉多糖的洗脫曲線及分子量大小

圖1 竹葉多糖的Sephcryl S-100洗脫曲線Fig.1 Bamboo-Leaf polysaccharide Sephcry S-100 elution curve

竹葉多糖BLP30經(jīng)Sephcryl S-100純化，共收集到2個(gè)主要多糖組分BLP30-1和BLP30-2。如圖1所示，通過(guò)SEC-LLS測(cè)定了BLP30-1和BLP30-2分子量（Mw）分別為2.9×104、2.1×104u。

2.2 單糖組成

經(jīng)GC測(cè)定，由圖2～圖4可知，BLP30-1和BLP30-2都是由巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖五種糖組成的。面積歸一化，BLP30-1的各單糖峰面積百分比分別為18.00%、25.65%、13.45%、25.99%、16.91%，其中木糖和葡萄糖含量最高。BLP30-2的各單峰面積百分比分別為25.40%、20.63%、17.25%、11.32%、25.40%，巖藻糖和半乳糖含量最高。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)糖樣中單糖的氣相色譜Fig.2 Gas chromatogram of the monosaccharides in standard sample

圖3 樣品BLP30-1的氣相色譜圖Fig.3 Gas chromatogram of the monosaccharides in BLP30-1

圖4 樣品BLP30-2的氣相色譜圖Fig.4 Gas chromatogram of the monosaccharides in BLP30-2

2.3 抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除活性 研究表明，自由基與機(jī)體的許多功能障礙和疾病的發(fā)生有關(guān)。因此，研究自由基的檢測(cè)方法并探討物質(zhì)對(duì)自由基的清除作用具有重要意義。DPPH（二苯代苦味酰自由基）分析法被廣泛用于清除自由基物質(zhì)性質(zhì)的研究，DPPH在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，其在517nm附近有強(qiáng)吸收（呈深紫色）。當(dāng)自由基清除劑存在時(shí)，DPPH的孤對(duì)電子被配對(duì)，其517nm吸收消失或減弱，通過(guò)測(cè)定吸收減弱的程度，可評(píng)價(jià)自由基清除劑的活性[9]。由圖5可以看出，隨著竹葉多糖濃度的增加，對(duì)DPPH清除的清除率呈上升趨勢(shì)。比較而言，BLP30-1具有更強(qiáng)的清除DPPH能力，但都弱于VC。BLP30-1、BLP30-2的IC50值分別為0.14、0.32mg/mL。

圖5 DPPH的清除活性Fig.5 Scavenging effects of the samples on DPPH radical

2.3.2 羥基自由基清除活性 羥基自由基是最活躍的自由基，可以輕易穿透細(xì)胞膜。羥基自由基會(huì)與重要的生物分子反應(yīng)包括碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA，導(dǎo)致組織損傷或細(xì)胞死，因此清除羥基自由基對(duì)保護(hù)生物系統(tǒng)是非常重要的[10-11]。由圖6可以看出，兩種多糖對(duì)羥基都有較好的清除活性，而且最終清除率都高于70%。當(dāng)濃度在1.6mg/mL時(shí)，BLP30-1清除率達(dá)到80%以上。維生素C濃度在0.8～1.6mg/mL時(shí)，清除活性均在90%以上。對(duì)羥基自由基而講，目前普遍有兩個(gè)機(jī)理：a.抑制羥基自由基的產(chǎn)生；b.清除羥基自由，本實(shí)驗(yàn)具體是哪種機(jī)理需要深入研究[12]。

圖6 羥基自由基的清除活性Fig.6 Scavenging effects of the samples hydroxyl radical

2.3.3 超氧自由基清除活性 超氧自由基是活性氧的一種，在體內(nèi)由過(guò)氧化物歧化酶清除，如果體內(nèi)過(guò)氧化物歧化酶活力下降或超氧產(chǎn)生過(guò)量都會(huì)對(duì)機(jī)體造成危害[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，竹葉多糖對(duì)羥基自由基的清除作用與多糖的劑量呈一定的量效關(guān)系，當(dāng)多糖的濃度為1.0mg/mL時(shí)，可以顯著抑制超氧自由基的產(chǎn)生（見(jiàn)圖7）。由圖7可知，維生素C抑制超氧自由基的效果并不理想。

3 結(jié)論

圖7 超氧自由基的清除活性Fig.7 Scavenging effects of the samples on superoxide radical

竹葉多糖經(jīng)DEAE Sepharose F F和Sephcryl S-100純化后得到兩個(gè)主要多糖組分BLP30-1和BLP30-2。對(duì)二者的單糖組成、分子質(zhì)量（Mw）測(cè)定表明，二者都有巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖五種糖組成，且分子量分別為分別為2.9×104、2.1×104u。對(duì)竹葉多糖進(jìn)行抗氧化活性研究表明，其在清除DPPH、羥基自由基、超氧自由基有較高的功效。因此，竹葉多糖用于保健食品或藥品開(kāi)發(fā)具有一定的價(jià)值，是一種優(yōu)良的天然活性物質(zhì)。

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