超聲對(duì)鼻咽癌拓?fù)涮婵禑峄煹脑鲂ё饔醚芯?/h1>
2013-12-05 05:41:12林盛饒明月吳敬波
成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào) 2013年3期
林盛，饒明月，吳敬波
（瀘州醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，瀘州 646000）
鼻咽癌是我國常見惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅生命健康，同步放化療是中晚期鼻咽癌的標(biāo)準(zhǔn)治療模式。拓?fù)涮婵担╰opotecan，TPT）是喜樹堿類半合成衍生物，水溶性好，臨床治療證實(shí)其可以作為肺［1］、卵巢［2］等惡性腫瘤的二線使用方案，在鼻咽癌［3］的治療中也有較好療效。熱化療是一種綠色腫瘤治療模式，增加患者對(duì)化療藥物敏感性，更能有效地殺傷惡性腫瘤細(xì)胞的同時(shí)減輕化療產(chǎn)生的毒副作用［4］。超聲波因其獨(dú)特的理化性質(zhì)，通過改變細(xì)胞膜的通透性而增加藥物濃度，具備與熱療相似的增效功能，兩者之間的差異目前報(bào)道較少。因此，本研究以人鼻咽癌細(xì)胞株（CNE－2）為對(duì)象，觀察超聲是否對(duì)TPT的熱化療殺傷效能有促進(jìn)作用，并結(jié)合電鏡對(duì)各組細(xì)胞的亞細(xì)結(jié)構(gòu)損傷性改變進(jìn)行觀察，旨在為超聲聯(lián)合熱化療治療鼻咽癌提供實(shí)驗(yàn)支持。
1 材料與方法
1.1 主要試劑和儀器
TPT粉針（黃石飛云），超聲理療儀（美國CHATTAHOOGA 公司），CCK－8試劑盒（碧云天），透射電子顯微鏡（日本株式會(huì)社），酶標(biāo)儀（美國BIO－RAD公司）。
1.2 細(xì)胞及培養(yǎng)
CNE－2，完全培養(yǎng)基，37℃、5%CO2孵箱常規(guī)培養(yǎng)。
1.3 半數(shù)抑制濃度（IC50）測定
1.3.1 拓?fù)涮婵堤幚砑癈CK8測定 貼壁細(xì)胞胰酶消化后重懸，調(diào)整濃度為5×104／mL，接種96孔板，每孔100μL細(xì)胞懸液，置恒溫孵箱內(nèi)培養(yǎng)貼壁，分別加入TPT 20μL，濃度依次為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μg／mL，每組3個(gè)復(fù)孔；作用1 h后，加入CCK8工作液10μL／孔，孵育2h，送檢酶標(biāo)儀（波長450nm）得到OD值，重復(fù)3遍后計(jì)算IC50。
1.3.2 IC50的計(jì)算 抑制率＝（1－實(shí)驗(yàn)組 OD值／對(duì)照組OD值）×100%，以加藥濃度的對(duì)數(shù)作為X，將生長抑制率作為Y，線形回歸后算出抑制率是50%時(shí)的加藥濃度，即IC50。
1.4 制備細(xì)胞懸液
對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，離心后重懸，調(diào)節(jié)濃度5×104個(gè)／mL，分設(shè)單純超聲組、單純TPT組、單純熱療組、熱療＋TPT組、超聲＋TPT熱化療組及空白對(duì)照組（TPT工作濃度0.08μg／mL，取IC50的20%）。
1.5 超聲處理
超聲處理依據(jù)超聲理療儀的性質(zhì)，探頭面積為1cm2，采用連續(xù)波，操作時(shí)加少許凡士林使凍存管底部與探頭接觸緊密，作用1min，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。
1.6 熱療處理
采用電熱恒溫水浴箱加熱（溫度波動(dòng)＜±0.1℃），先將1只500mL燒杯用鉛塊固定于恒溫水浴箱底部，內(nèi)盛1.5 cm水共同升溫至37℃，將熱療＋TPT組、單純熱療組、超聲＋TPT熱化療組3管捆縛一起置于燒杯底部加熱至43℃，恒溫處理1h，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。
1.7 電鏡觀察
單純超聲組、單純TPT組、單純熱療組、熱療＋TPT組、超聲＋TPT熱化療組，各抽取0.5mL細(xì)胞懸液于EP管，1 000r／min離心5min，細(xì)胞沉淀用戊二醛固定后電鏡觀察細(xì)胞亞細(xì)結(jié)構(gòu)。
1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行完全隨機(jī)方差分析，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為α＝0.05。
2 結(jié)果
2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
CNE－2細(xì)胞呈貼壁生長，形態(tài)大小各異，核大有分裂，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期后隔天傳代（見圖1）。
2.2 IC50結(jié)果
測得OD值計(jì)算抑制率，利用直線回歸計(jì)算出抑制率為50%時(shí)的藥物濃度即IC50，取3次實(shí)驗(yàn)的平均值得出TPT對(duì)CNE－2的IC50為0.396μg／mL。
2.3 超聲聯(lián)合
熱療聯(lián)合TPT對(duì)CNE－2的抑制作用：單一處理因素間比較，熱療對(duì)細(xì)胞株的抑制作用與藥物組相當(dāng)，明顯強(qiáng)于超聲組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。熱化療組、超聲＋TPT熱化療組對(duì)細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.000＜0.01）（見表1）。
2.4 電鏡結(jié)果
2.4.1 對(duì)照組與單純藥物組的電鏡圖像 對(duì)照組電鏡顯示：細(xì)胞的核質(zhì)疏松，胞質(zhì)中線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)顯示清楚，分裂核象，說明細(xì)胞的增殖能力強(qiáng)（見圖2）。單純藥物組電鏡顯示：細(xì)胞核中異染色質(zhì)增多并伴染色質(zhì)固縮使胞核縮小，重要細(xì)胞器有損傷性改變，增殖能力受到抑制（標(biāo)記為蔥皮樣改變的髓樣結(jié)構(gòu)，提示線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能出現(xiàn)不可逆損傷性改變，見圖3）。
圖1 CNE－2細(xì)胞（×200）（傳代培養(yǎng)后第4天）
表1 超聲聯(lián)合TPT熱化療對(duì)CNE－2的抑制效應(yīng)
2.4.2 單純超聲／熱療組電鏡圖像 單純超聲組電鏡顯示：細(xì)胞核固縮，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)水腫樣改變（箭頭所示，可逆損傷），提示細(xì)胞增殖能力有減弱（見圖4）。單純熱療組電鏡顯示：細(xì)胞核回縮，在核膜周邊出現(xiàn)大量高密度異染色質(zhì)沉積，細(xì)胞增殖能力明顯抑制（見圖5）。
2.4.3 超聲聯(lián)合TPT熱化療電鏡圖像 熱療聯(lián)合TPT電鏡圖像：細(xì)胞核中異染色質(zhì)明顯增多，電子密度高，核／質(zhì)比明顯減少伴線粒體減少趨勢及髓樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)（箭頭所示），增殖能力明顯減弱（見圖6）。超聲聯(lián)合TPT熱化療電鏡圖像：線粒體水腫明顯或者消失，胞質(zhì)內(nèi)有大量的空泡結(jié)構(gòu)出現(xiàn)（為細(xì)胞器破壞后表現(xiàn)），核質(zhì)固縮裂解，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡、壞死趨勢（見圖7）。
3 討論
鼻咽癌是我國常見惡性腫瘤，同步放化療是中晚期鼻咽癌的標(biāo)準(zhǔn)治療模式。篩選有效的化療藥物作為聯(lián)合手段能為放療增益。課題組前期致力研究喜樹堿類藥物在鼻咽癌治療中的作用，證實(shí)其對(duì)鼻咽癌有放射增敏效能［5］。超聲的抗瘤效應(yīng)最早由Szent－Gy?rgyi等［6］在1933年在動(dòng)物腫瘤模型上證實(shí)。隨后的研究［7－9］揭示了其可能的抗瘤機(jī)制，主要包括空化效應(yīng)及輻射沖擊，使皮膚黏膜或細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，從而增加細(xì)胞對(duì)藥物的攝取量，增強(qiáng)對(duì)靶細(xì)胞的殺傷。大量研究表明，高溫能增強(qiáng)某些化療藥物的細(xì)胞毒作用，在42℃作用2h能使一些化療藥物抗癌效果增強(qiáng)10～100倍，其作用機(jī)制首先是直接的細(xì)胞毒作用，熱療的靶器官是細(xì)胞膜，加熱后細(xì)胞膜的主要成分，如磷脂質(zhì)等受到影響，質(zhì)膜的流動(dòng)性和通透性均發(fā)生改變；其次，加熱改變膜的通透性利于化學(xué)藥物的滲透和吸收，增加細(xì)胞對(duì)藥物的攝取量使腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物濃度提高；高溫能抑制藥物引起的腫瘤細(xì)胞損傷修復(fù)，如減少DNA的斷裂修復(fù)和DNA合成。其他機(jī)制［10］包括抑制熱休克蛋白（HSP）的累積及使藥物反應(yīng)速度加快，增加溫度依賴藥物抗腫瘤活性。
綜合以上研究背景，本實(shí)驗(yàn)探討超聲能否對(duì)TPT的熱化療殺傷效應(yīng)起到促進(jìn)作用。結(jié)果證實(shí)，熱療聯(lián)合TPT后加強(qiáng)了藥物的殺傷效應(yīng)，在相同的藥物作用時(shí)間前提下，熱化療組對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的抑制效應(yīng)是強(qiáng)于單純藥物組的；通過電鏡對(duì)處理后細(xì)胞的亞細(xì)結(jié)構(gòu)觀察，熱化療組的細(xì)胞分裂增殖能力明顯弱于單純藥物組，細(xì)胞器受到更為嚴(yán)重的損傷，說明熱療對(duì)TPT有增效作用。超聲聯(lián)合后使TPT熱化療殺傷效應(yīng)進(jìn)一步提高，細(xì)胞器消亡，細(xì)胞處于凋亡壞死狀態(tài)，說明超聲對(duì)TPT熱化療殺傷有增效作用。超聲是一種波動(dòng)形式，其振動(dòng)可引起生物大分子、細(xì)胞及組織結(jié)構(gòu)處于激烈的機(jī)械運(yùn)動(dòng)場中，使其結(jié)構(gòu)功能發(fā)生變化；超聲波也是一種能量形式，引起細(xì)胞膜損傷或增強(qiáng)溶酶體活性及蛋白質(zhì)損傷而使細(xì)胞死亡。由于組織小氣泡的存在，超聲可引起微小氣泡或其周圍溫度升高，產(chǎn)生的氧自由基及高速微熱流使細(xì)胞受到嚴(yán)重的損傷乃至破壞［11］。
超聲可以作為增效手段為鼻咽癌患者的治療帶來福音，但同時(shí)也存在一些問題如超聲作用時(shí)間長短及強(qiáng)度是否會(huì)影響其增益作用，對(duì)藥物的促滲有無特指性和局限性，有無可能改善化療藥物的耐藥及可能的分子機(jī)制等都尚待進(jìn)一步研究加以確認(rèn)。
［1］Jotte R，Conkling P，Reynolds C，et al.Randomized phase II trial of single－agent amrubicin or topotecan as second－line treatment in patients with small－cell lung cancer sensitive to first－line platinum－based chemotherapy ［J］.J Clin Oncol，2011，29（3）：287－293.
［2］Tsunetoh S，Terai Y，Sasaki H，et al.Effect of a topoisomerase－1inhibitor （topotecan）on the efficacy of cisplatin in in vitro and in vivo platinum－resistant ovarian cancer models［J］.J Clin Oncol，2010，28（15suppl）：e13160.
［3］何麗佳，吳敬波，文慶蓮.拓?fù)涮婵挡煌瑫r(shí)間給藥對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞放射增敏作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.臨床腫瘤學(xué)雜志，2010，15（6）：511－513.
［4］Huang T，Gong W，Li X，et al.Enhancement of osteosarcoma cell sensitivity to cisplatin using paclitaxel in the presence of hyperthermia［J］.Int J Hyperthermia，2013，29（3）：248－255.
［5］吳敬波，文慶蓮，范娟，等.拓?fù)涮婵祵?duì)鼻咽癌放射增敏的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)［J］.中國耳鼻咽喉頭頸外科，2007，14（2）：82－85.
［6］Szent－Gy?rgyi A. Chemical and biological effects of ultrasounic radiation［J］.Nature，1933，130：131－278.
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［8］Rapoport N，Nam KH，Gupta R，et al.Ultrasound－mediated tumor imaging and nanotherapy using drug loaded，block copolymer stabilized perfluorocarbon nanoemulsions ［J］.J Control Release，2011，153（1）：4－15.
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［10］Polat BE，Hart D，Langer R，et al.Ultrasound－mediated transdermal drug delivery：mechanisms，scope，and emerging trends［J］.J Control Release，2011，152（3）：330－348.
［11］Zhang XL，Hu AB，Cui SZ，et al.Thermotherapy enhances oxaliplatin－induced cytotoxicity in human colon carcinoma cells［J］.World J Gastroenterol，2012，18（7）：646－653.
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1 材料與方法
1.1 主要試劑和儀器
TPT粉針（黃石飛云），超聲理療儀（美國CHATTAHOOGA 公司），CCK－8試劑盒（碧云天），透射電子顯微鏡（日本株式會(huì)社），酶標(biāo)儀（美國BIO－RAD公司）。
1.2 細(xì)胞及培養(yǎng)
CNE－2，完全培養(yǎng)基，37℃、5%CO2孵箱常規(guī)培養(yǎng)。
1.3 半數(shù)抑制濃度（IC50）測定
1.3.1 拓?fù)涮婵堤幚砑癈CK8測定 貼壁細(xì)胞胰酶消化后重懸，調(diào)整濃度為5×104／mL，接種96孔板，每孔100μL細(xì)胞懸液，置恒溫孵箱內(nèi)培養(yǎng)貼壁，分別加入TPT 20μL，濃度依次為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μg／mL，每組3個(gè)復(fù)孔；作用1 h后，加入CCK8工作液10μL／孔，孵育2h，送檢酶標(biāo)儀（波長450nm）得到OD值，重復(fù)3遍后計(jì)算IC50。
1.3.2 IC50的計(jì)算 抑制率＝（1－實(shí)驗(yàn)組 OD值／對(duì)照組OD值）×100%，以加藥濃度的對(duì)數(shù)作為X，將生長抑制率作為Y，線形回歸后算出抑制率是50%時(shí)的加藥濃度，即IC50。
1.4 制備細(xì)胞懸液
對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，離心后重懸，調(diào)節(jié)濃度5×104個(gè)／mL，分設(shè)單純超聲組、單純TPT組、單純熱療組、熱療＋TPT組、超聲＋TPT熱化療組及空白對(duì)照組（TPT工作濃度0.08μg／mL，取IC50的20%）。
1.5 超聲處理
超聲處理依據(jù)超聲理療儀的性質(zhì)，探頭面積為1cm2，采用連續(xù)波，操作時(shí)加少許凡士林使凍存管底部與探頭接觸緊密，作用1min，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。
1.6 熱療處理
采用電熱恒溫水浴箱加熱（溫度波動(dòng)＜±0.1℃），先將1只500mL燒杯用鉛塊固定于恒溫水浴箱底部，內(nèi)盛1.5 cm水共同升溫至37℃，將熱療＋TPT組、單純熱療組、超聲＋TPT熱化療組3管捆縛一起置于燒杯底部加熱至43℃，恒溫處理1h，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。
1.7 電鏡觀察
單純超聲組、單純TPT組、單純熱療組、熱療＋TPT組、超聲＋TPT熱化療組，各抽取0.5mL細(xì)胞懸液于EP管，1 000r／min離心5min，細(xì)胞沉淀用戊二醛固定后電鏡觀察細(xì)胞亞細(xì)結(jié)構(gòu)。
1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行完全隨機(jī)方差分析，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為α＝0.05。
2 結(jié)果
2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
CNE－2細(xì)胞呈貼壁生長，形態(tài)大小各異，核大有分裂，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期后隔天傳代（見圖1）。
2.2 IC50結(jié)果
測得OD值計(jì)算抑制率，利用直線回歸計(jì)算出抑制率為50%時(shí)的藥物濃度即IC50，取3次實(shí)驗(yàn)的平均值得出TPT對(duì)CNE－2的IC50為0.396μg／mL。
2.3 超聲聯(lián)合
熱療聯(lián)合TPT對(duì)CNE－2的抑制作用：單一處理因素間比較，熱療對(duì)細(xì)胞株的抑制作用與藥物組相當(dāng)，明顯強(qiáng)于超聲組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。熱化療組、超聲＋TPT熱化療組對(duì)細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.000＜0.01）（見表1）。
2.4 電鏡結(jié)果
2.4.1 對(duì)照組與單純藥物組的電鏡圖像 對(duì)照組電鏡顯示：細(xì)胞的核質(zhì)疏松，胞質(zhì)中線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)顯示清楚，分裂核象，說明細(xì)胞的增殖能力強(qiáng)（見圖2）。單純藥物組電鏡顯示：細(xì)胞核中異染色質(zhì)增多并伴染色質(zhì)固縮使胞核縮小，重要細(xì)胞器有損傷性改變，增殖能力受到抑制（標(biāo)記為蔥皮樣改變的髓樣結(jié)構(gòu)，提示線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能出現(xiàn)不可逆損傷性改變，見圖3）。
圖1 CNE－2細(xì)胞（×200）（傳代培養(yǎng)后第4天）
表1 超聲聯(lián)合TPT熱化療對(duì)CNE－2的抑制效應(yīng)
2.4.2 單純超聲／熱療組電鏡圖像 單純超聲組電鏡顯示：細(xì)胞核固縮，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)水腫樣改變（箭頭所示，可逆損傷），提示細(xì)胞增殖能力有減弱（見圖4）。單純熱療組電鏡顯示：細(xì)胞核回縮，在核膜周邊出現(xiàn)大量高密度異染色質(zhì)沉積，細(xì)胞增殖能力明顯抑制（見圖5）。
2.4.3 超聲聯(lián)合TPT熱化療電鏡圖像 熱療聯(lián)合TPT電鏡圖像：細(xì)胞核中異染色質(zhì)明顯增多，電子密度高，核／質(zhì)比明顯減少伴線粒體減少趨勢及髓樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)（箭頭所示），增殖能力明顯減弱（見圖6）。超聲聯(lián)合TPT熱化療電鏡圖像：線粒體水腫明顯或者消失，胞質(zhì)內(nèi)有大量的空泡結(jié)構(gòu)出現(xiàn)（為細(xì)胞器破壞后表現(xiàn)），核質(zhì)固縮裂解，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡、壞死趨勢（見圖7）。
3 討論
鼻咽癌是我國常見惡性腫瘤，同步放化療是中晚期鼻咽癌的標(biāo)準(zhǔn)治療模式。篩選有效的化療藥物作為聯(lián)合手段能為放療增益。課題組前期致力研究喜樹堿類藥物在鼻咽癌治療中的作用，證實(shí)其對(duì)鼻咽癌有放射增敏效能［5］。超聲的抗瘤效應(yīng)最早由Szent－Gy?rgyi等［6］在1933年在動(dòng)物腫瘤模型上證實(shí)。隨后的研究［7－9］揭示了其可能的抗瘤機(jī)制，主要包括空化效應(yīng)及輻射沖擊，使皮膚黏膜或細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，從而增加細(xì)胞對(duì)藥物的攝取量，增強(qiáng)對(duì)靶細(xì)胞的殺傷。大量研究表明，高溫能增強(qiáng)某些化療藥物的細(xì)胞毒作用，在42℃作用2h能使一些化療藥物抗癌效果增強(qiáng)10～100倍，其作用機(jī)制首先是直接的細(xì)胞毒作用，熱療的靶器官是細(xì)胞膜，加熱后細(xì)胞膜的主要成分，如磷脂質(zhì)等受到影響，質(zhì)膜的流動(dòng)性和通透性均發(fā)生改變；其次，加熱改變膜的通透性利于化學(xué)藥物的滲透和吸收，增加細(xì)胞對(duì)藥物的攝取量使腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物濃度提高；高溫能抑制藥物引起的腫瘤細(xì)胞損傷修復(fù)，如減少DNA的斷裂修復(fù)和DNA合成。其他機(jī)制［10］包括抑制熱休克蛋白（HSP）的累積及使藥物反應(yīng)速度加快，增加溫度依賴藥物抗腫瘤活性。
綜合以上研究背景，本實(shí)驗(yàn)探討超聲能否對(duì)TPT的熱化療殺傷效應(yīng)起到促進(jìn)作用。結(jié)果證實(shí)，熱療聯(lián)合TPT后加強(qiáng)了藥物的殺傷效應(yīng)，在相同的藥物作用時(shí)間前提下，熱化療組對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的抑制效應(yīng)是強(qiáng)于單純藥物組的；通過電鏡對(duì)處理后細(xì)胞的亞細(xì)結(jié)構(gòu)觀察，熱化療組的細(xì)胞分裂增殖能力明顯弱于單純藥物組，細(xì)胞器受到更為嚴(yán)重的損傷，說明熱療對(duì)TPT有增效作用。超聲聯(lián)合后使TPT熱化療殺傷效應(yīng)進(jìn)一步提高，細(xì)胞器消亡，細(xì)胞處于凋亡壞死狀態(tài)，說明超聲對(duì)TPT熱化療殺傷有增效作用。超聲是一種波動(dòng)形式，其振動(dòng)可引起生物大分子、細(xì)胞及組織結(jié)構(gòu)處于激烈的機(jī)械運(yùn)動(dòng)場中，使其結(jié)構(gòu)功能發(fā)生變化；超聲波也是一種能量形式，引起細(xì)胞膜損傷或增強(qiáng)溶酶體活性及蛋白質(zhì)損傷而使細(xì)胞死亡。由于組織小氣泡的存在，超聲可引起微小氣泡或其周圍溫度升高，產(chǎn)生的氧自由基及高速微熱流使細(xì)胞受到嚴(yán)重的損傷乃至破壞［11］。
超聲可以作為增效手段為鼻咽癌患者的治療帶來福音，但同時(shí)也存在一些問題如超聲作用時(shí)間長短及強(qiáng)度是否會(huì)影響其增益作用，對(duì)藥物的促滲有無特指性和局限性，有無可能改善化療藥物的耐藥及可能的分子機(jī)制等都尚待進(jìn)一步研究加以確認(rèn)。
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