劉杰昌，王 瑩，黎建至，黃汗青，歐輝超

(暨南大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣州510632)

對于研究野外動物生活習(xí)性來說，了解其食性是很關(guān)鍵的一環(huán)。只有了解動物的食性才能研究該動物在食物鏈的地位、適應(yīng)環(huán)境的能力和了解環(huán)境中物種的變化等。并且可通過動物的食性了解其營養(yǎng)狀況，有利于珍稀物種的研究保護［1］。

研究動物的食性有幾種方法，一種是直接觀察。但是如果要研究活動范圍大的動物［2］所耗費的時間會很多。而且環(huán)境中的物種組成復(fù)雜也會增加檢測時的難度。第二種是通過動物的腸道內(nèi)容物研究其食物組成［3］，這種方法廣泛應(yīng)用在野外，但不適用于瀕危動物的研究，尤其在復(fù)雜的環(huán)境中相比直接觀察更有效率。還有一種方法是利用動物的糞便研究食物組成，有時候?qū)τ谘芯空湎游锘蛘呤欠植枷∈璧膭游飦碚f，糞便的收集往往比腸道物收集來得容易，而且對動物的干擾更小［4］。

利用糞便研究動物食性的技術(shù)具有收集方便，對動物干擾小等優(yōu)點。目前國內(nèi)外有幾種慣用的以糞便為基礎(chǔ)的技術(shù)。例如利用顯微技術(shù)分辨出糞便中微植物組織，但是這種方法由于有時候因為糞便中存在著比較多種的植物碎片導(dǎo)致了錯認(rèn)和漏認(rèn)［5］，而且往往需要研究人員具備專業(yè)的植物形態(tài)學(xué)分類知識和掌握大量的植物種類特征。利用碳氮穩(wěn)定同位素檢測動物食性在之前是一項比較流行的研究方法，雖然這項技術(shù)能夠定性定量檢測出動物中的食物組成［6］，但如果要研究食性廣泛的動物這項技術(shù)會有很大的限制［7］。

而隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以DNA條形碼技術(shù)為基礎(chǔ)的研究逐漸成為一種非常有前景的方法，它利用一段DNA序列來作為檢測各物種的標(biāo)記［8］，物種［9］和環(huán)境樣本［10，11］都能通過 DNA 條形碼技術(shù)來確認(rèn)其分類學(xué)上的關(guān)系。理想的DNA條形碼應(yīng)該是一段標(biāo)準(zhǔn)、穩(wěn)定、盡量短但是又能表現(xiàn)出種間差異。但是到現(xiàn)在還沒有找到一條符合各個標(biāo)準(zhǔn)的DNA條形碼，于是研究學(xué)者會根據(jù)研究的目的而對標(biāo)準(zhǔn)有所側(cè)重。例如分類學(xué)家會首先考慮DNA條形碼是否標(biāo)準(zhǔn)，包含足夠的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)信息。而生態(tài)學(xué)者會考慮DNA條形碼是否穩(wěn)定和容易從環(huán)境材料中擴增降解的DNA。實驗中所研究的rbcL-a序列是質(zhì)體編碼Rubisco大亞基，簡稱 rbcL基因(ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase large subunit gene)的一部分，最早由Poinar提出并應(yīng)用于糞便中植物物種檢測。它全長只有157 bp，具有從高度降解的環(huán)境樣本中擴增出DNA序列段的能力［12］。本研究模擬野外樣本的檢測方法，利用rbcL-a序列檢測小白鼠糞便中的植物物種，初步探究rbcL-a序列應(yīng)用于小鼠糞便中植物物種檢測的效果。

1 材料與方法

1.1 模擬環(huán)境樣本的收集

小白鼠是實驗中經(jīng)常用到的材料，且小鼠對食物并沒有特殊的偏好和厭惡，正好用來作為本次實驗的研究對象。本研究從動物房中買來16只小白鼠，分成2組，每組8只。由于小白鼠體型較小，要收集足夠?qū)嶒灥募S便的量需要大量的時間，而且為了使糞便都來自同一個時間段，本研究把每組8只小白鼠的糞便收集在一起。挑選6種植物(表1)對小白鼠進行飼養(yǎng)，考慮到小白鼠的體型較小，食量較少，本研究把6種植物分成2份。在前兩天的中午和晚上，按時定性定量喂給小白鼠第一組植物(花椰菜、小麥、生菜)，然后，為了防止食物跟糞便粘連，在第3 d的傍晚清理糞便并不再喂食。到第4 d的早上收集糞便，糞便用1.5 mL的離心管裝好，寫上日期，得到了A組和B組糞便樣本，樣本直接放到-20℃冰箱中保存直至DNA提取。喂食小白鼠第二組植物(白菜、玉米、胡蘿卜)并按照第一組的流程進行，在飼養(yǎng)結(jié)束后得到了C組和D組糞便樣本。

表1 實驗所用的6種植物學(xué)名及分類Tab 1 Botanical names and classification of 6 plants used in the experiment

1.2 糞便DNA提取及擴增

收集的4組糞便樣本，用液氮研磨成粉狀。利用OMEGA公司所提供的HP Plant DNA Mini Kit試劑盒進行總量DNA提取，方法步驟遵循著說明書的指引。為了消除糞便中腐植酸、酚類化合物對后面試驗的影響，在步驟中加入OMEGA公司的HTR Reagent去除糞便中的污染物。PCR反應(yīng)在50 μL的總量進行:2 μL DNA 模板，2 mM MgCl2，0.05 mg BSA，250 μM dNTPs ，200 nM primer，1 U Taq酶和1×PCR buffer。PCR 反應(yīng)所用試劑為Takara公司產(chǎn)品。rbcL-a序列的正向引物:5'-ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGCAAGT-'3，反向:5'-CTTCTTCAGGTGGAACTCCAG'-3。rbcL-a序列與PCR反應(yīng)條件參照Poinar［12］的研究。

1.3 PCR回收、克隆與測序

PCR產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司)進行DNA回收，利用TaKaRa公司的pMD18-T Vector試劑盒進行TA克隆連接。已連接的載體轉(zhuǎn)化到制備好的DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過藍(lán)白斑篩選后，挑取單菌落制成菌液，送去上海生工生物工程有限公司使用ABI-PRISM3730測序儀進行單向測序。

1.4 序列分析

測序得到的序列利用ClusterX［13］軟件進行完全比對。由于A組和B組糞便中食物組成是一樣的，C組和D組同上，所以把它們兩兩結(jié)合起來比對。比對中出現(xiàn)3次或3次以上的序列稱為共有序列［14］，出現(xiàn)的共有序列會進行下一步的物種分析。如果某一序列假設(shè)為A序列，在樣本中出現(xiàn)1～2次，并跟共有序列比對只出現(xiàn)1個堿基的差異，我們認(rèn)為這是共有序列在測序時發(fā)生錯誤產(chǎn)生A序列，不進行下一步的物種分析。但是只出現(xiàn)1～2次，與共有序列比對有2個或2個以上的堿基差異的序列我們排除這是測序發(fā)生的錯誤，并進行下一步的物種分析。

所有得到的共有序列與達不到共有序列的條件，但也排除了測序錯誤可能的序列的物種分析利用BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi)［15］，將序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中植物序列進行比對。在慣有的比對標(biāo)準(zhǔn)，要使序列與物種匹配，序列與物種序列的相似度要達到98%以上和100%的序列覆蓋率［16］。為了縮小篩選范圍，我們把相似度提高到99%以上。如果序列能夠跟兩個或者更多的物種匹配，則把序列分配到包含所有匹配的物種的更高分類單元上［14］。與序列匹配的物種中如果含有序列相似度達到100%的物種，則不考慮相似度為99%的物種。

為了鑒定到更精確的分類單元，我們提取實驗中用到的6種植物DNA并進行rbcL-a序列的PCR擴增，得到的PCR產(chǎn)物直接送到上海生工生物工程有限公司進行TA克隆測序(每種植物都挑取10個單克隆進行測序)。所有從糞便樣本得到的序列都會與得到的6種植物rbcL-a序列進行比對。如果序列與某種植物rbcL-a序列的相似度和序列覆蓋率都達到100%，則認(rèn)為該序列屬于此植物物種。

2 結(jié)果與分析

本研究從4組糞便中共得到130條序列(每組31～36條)，在物種分析中除了排除低于標(biāo)準(zhǔn)(覆蓋率100%與99%以上相似度)的序列，我們還發(fā)現(xiàn)了與序列相匹配的物種序列描述是位于線粒體中的編碼Rubisco大亞基假基因或者是線粒體基因。這種情況可能是因為植物線粒體中也存在著rbcL基因，出現(xiàn)實驗中擴增了線粒體rbcL基因或者與rbcL基因相似的假基因的現(xiàn)象。凡是有與線粒體基因匹配的序列我們都認(rèn)為是引物擴增了錯誤序列并排除［17］。

在擴增6種植物rbcL-a序列中我們得到了5種植物的PCR產(chǎn)物，但是并沒有發(fā)現(xiàn)玉米的PCR產(chǎn)物，這在C組、D組的序列比對中同樣沒有找到與玉米種屬關(guān)系相近的序列。5種植物的PCR產(chǎn)物經(jīng)測序得到的序列與GenBank物種序列進行比對，在排除了假基因序列與覆蓋率、相似度不符合本實驗標(biāo)準(zhǔn)的序列，得到了生菜、花椰菜、胡蘿卜和白菜物種的唯一序列。序列已提交到日本DNA數(shù)據(jù)庫DDBJ(DNA Data Bank of Japan)。編號為:AB711139-AB711142。小麥 PCR產(chǎn)物經(jīng)測序得到兩條序列，這兩條序列互相比對發(fā)現(xiàn)其相似度只有98%(覆蓋率100%)，與GenBank序列比對中其分類單元都?xì)w屬到禾本科。

各組糞便樣本得到的序列利用GenBank數(shù)據(jù)庫比對所匹配的分類單位在表2中。序列所屬的分類單元大部分都?xì)w屬到科，其中D組出現(xiàn)了屬的分類單元。序列與測序得到5種植物rbcL-a序列進行比對，發(fā)現(xiàn)花椰菜、胡蘿卜和生菜物種的rbcL-a序列分別有序列與之相似度達到100%，這三條待分析序列分別對應(yīng)著表2中A、B、C、D組的十字花科、D組的傘形科和蕓薹屬。

表2 利用BLAST軟件檢測到的植物分類單位(括號為該分類單元序列與5種植物rbcL-a序列比對所匹配的植物物種)Tab 2 Plant taxa detected with BLAST program(plant species in the brackets were belonged to the taxa sequence which was matched to 5 plant species of rbcL-a sequences

有趣的是，A組與B組鑒定到十字花科的序列與C組、D組鑒定到十字花科的序列的相似度為100%(覆蓋率100%)，也就是說，C組與D組中也出現(xiàn)了花椰菜的序列?；ㄒ伺c白菜同屬十字花科蕓苔屬，兩植物物種測序得到的序列顯示花椰菜與白菜的rbcL-a序列只相差一個堿基，但是兩種植物在挑取單克隆測序得到的序列并沒有出現(xiàn)相互混雜的情況，也就排除了在生菜物種中擴增出能與花椰菜物種匹配的序列的可能性。根據(jù)實驗中植物分組的情況，C組與D組出現(xiàn)的十字花科序列有可能是其糞便中殘留有花椰菜碎屑，但這需要進一步的實驗說明。

在A組與B組的序列中我們發(fā)現(xiàn)有序列能夠匹配到禾本科的分類單元，但是與得到的兩條小麥rbcL-a序列比對其覆蓋率與相似度并沒有達到實驗中要求的標(biāo)準(zhǔn)。不能確定是否得到了正確的小麥rbcL-a序列。鑒于之前的實驗我們并沒有得到玉米物種的PCR產(chǎn)物，我們認(rèn)為rbcL-a序列可能不適用于檢測禾本科物種。6種植物rbcL-a序列測序中雖然得到了生菜rbcL-a序列，但是樣本A組與B組的序列中我們并沒有發(fā)現(xiàn)與生菜科屬有關(guān)的序列。這可能是在飼養(yǎng)過程中小白鼠并沒有把生菜當(dāng)做食物(即使在清理籠子里的糞便時我們只發(fā)現(xiàn)了生菜的碎片)，只當(dāng)作磨牙用。

3 討論

本實驗利用rbcL-a序列結(jié)合分子克隆對小白鼠糞便進行物種檢測，具有操作簡單、快捷等特點。測序得到的130條序列利用GenBank數(shù)據(jù)庫比對鑒定出3科和1屬。與單獨擴增測序得到的5種植物的rbcL-a序列進行比對，發(fā)現(xiàn)有待分析序列與花椰菜、白菜和胡蘿卜物種rbcL-a序列的相似性達到100%(序列覆蓋率100%)，分別確定其為花椰菜、白菜和胡蘿卜物種的序列。實驗結(jié)果表明利用rbcL-a序列模擬檢測小鼠糞便中的6個植物物種大部分能夠鑒定到科甚至屬的分類單位。通常野外植食性動物或者是雜食性動物食物來源廣泛，如果所研究的野外動物的食物來源不是太局限于某一個植物的科屬的話，利用rbcL-a序列應(yīng)用到野外動物糞便中的植物物種檢測還是能夠取得很好的效果。

rbcL-a作為檢測野外樣本中的植物物種的條形碼工具還是具有其獨特的優(yōu)勢。只有157 bp的長度使它容易從環(huán)境樣本中擴增出DNA序列。雖然它的進化速率不是很高［18］，在實驗中它難以區(qū)分科以下的分類單位。但是如果能夠建立一個所研究的當(dāng)?shù)刂参镂锓N的序列庫［19］與待分析序列進行比對(類似本實驗的研究方法)，則能夠使待分析序列匹配到一個更低的分類單元。

在實驗中，我們發(fā)現(xiàn)糞便對樣本中的殘留植物DNA影響較大。相比于直接提取植物DNA擴增得到的rbcL-a序列比較單一且穩(wěn)定，從糞便中提取并擴增出來的序列具有很大的多樣性。除了擴增出線粒體假基因(這種情況在擴增6種植物rbcL-a序列段也同樣存在)以外，也出現(xiàn)了很多在GenBank中找不到相似物種的序列，或者是擴增了質(zhì)體中的其它序列段。在C組的測序結(jié)果中，其大部分序列都由一種單一共有序列構(gòu)成，且這段序列在GenBank相似度比對中顯示的是植物質(zhì)體的trnL基因，這也是C組與D組重現(xiàn)性不好的原因。幸好在技術(shù)方面，高通量、大規(guī)模測序已逐漸成為一股新的力量推動著DNA條形碼技術(shù)高速發(fā)展［20］，有利于彌補擴增和測序錯誤等缺點，也節(jié)省了大量的時間(重復(fù)挑取單克隆的效率不高)。而隨著利用植物DNA條形碼對野外樣本的物種研究的深入，還有很多DNA條形碼像rbcL-a一樣投入這方面的研究，例如p6 loop序列［16］。相信在不久的將來，研究者在利用植物DNA條形碼對野外樣本的研究會取得更加矚目的成果。

［1］鐵 軍，張 晶，彭林鵬，等.神農(nóng)架川金絲猴冬春季節(jié)食性分析［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2010，29(1):62-68.

［2］朱 磊，丁 偉，唐利洲，等.黃臀鵯秋冬季食性及取食生態(tài)位的初步觀察［J］. 四川動物，2010，29(6):981-983.

［3］Juen A，Traugott M.Detecting predation and scavenging by DNA gut-content analysis:a case study using a soil insect predator-prey system［J］.Oecologia，2005，142(3):344-352.

［4］Fumanal B，Martin J F，Bon M C.High through-put characterization of insect morphocryptic entities by a non-invasive method using direct-PCR of fecal DNA［J］.Journal of Biotechnology，2005，119(2005):15-19.

［5］Gill R B，Carpenter L H，Bartmann R M，et al.Fecal analysis to estimate mule deer diets［J］.The Journal of Wildlife Management，1983，47(4):902-915.

［6］Dove H，Mayes R W.Plant wax components:a new approach to estimating intake and diet composition in herbivores［J］.The Journal of Nutrition，1996，126(1):13-26.

［7］Zhou Q，Xie P，Xu J，et al.Seasonal variations in stable isotope ratios of two biomanipulation fishes and seston in a large pen culture in hypereutrophic Meiliang Bay，Lake Taihu［J］.Ecological Engineering，2009，35(2009):1603-1609.

［8］Paul D N H，Alina C，Shelley L B，et al.Biological identifications through DNA barcodes［J］.The Royal Society，2003，270(2003):313-321.

［9］Paul D N H，Mark Y S，Tyler S Z，et al.Identification of birds through DNA barcodes［J］.PLoS Biol，2004，2(10):e312.

［10］Gentile F F，Claude M，F(xiàn)ranc O P，et al.Species detection using environmental DNA from water samples［J］.The Royal Society，2008，4(4):423-425.

［11］Vicente G A，Gary M K，Klaus N.Comparative bacterial diversity in recent Hawaiian volcanic depo sits of different ages［J］.FEMS microbiology ecology，2007，60(1):60-73.

［12］Poinar H N，Hofreiter M，Spaulding W G，et al.Molecular coproscopy:dung and diet of the extinct ground sloth Nothrotheriops shastensis［J］.Science，1998，281(5375):319-320.

［13］Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，et al.The CLUSTAL_X windows interface:flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis to ols［J］.Nucleic Acids Reseach，1997，25(24):4876-4882.

［14］Alice V，Christian M，Muhammad A N，et al.New perspectives in diet analysis based on DNA barcoding and parallel pyrosequencing:the trn-Lapproach［J］.Molecular Ecology Resources，2009，9(2009):51-60.

［15］Altschul S F，Madden T L，Sch?ffer A A，et al.Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs［J］.Nucleic Acids Research，1997，25(17):3389-3402.

［16］Soininen E M，Valentini A，Coissac E，et al.Analysing diet of small herbivores:the efficiency of DNA barcoding coupled with high-throughput pyrosequencing for deciphering the composition of complex plant mixtures［J］.Frontiers in Zoology，2009，6(1):16.

［17］Song H，Buhay J E，Whiting M F，et al.Many species in one:DNA barcoding overestimates the number of species when nuclear mitochondrial pseudogenes are coamplified［J］.The National Academy of Sciences of the USA，2008，105(36):13486-13491.

［18］Newmaster S G，F(xiàn)azekas A J，Steeves R A，et al.Testing candidate plant barcode regions in the Myristicaceae［J］.Molecular Ecology Resources，2008，8(3):480-490.

［19］Bradley B J，Stiller M，Doran-Sheehy D M，et al.Plant DNA sequences from feces:potential means for assessing diets of wild primates［J］.A-merican Journal of Primatology，2007，69(6):669-705.

［20］Novais R C，Thorstenson Y R.The evolution of pyrosequencing for microbiology:from genes to genomes［J］.Journal of Microbiological Methods，2011，86(1):1-7.