王美玲，吳茜茜，蔡敬民，

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥230036;2.合肥學(xué)院生物與環(huán)境工程系，安徽合肥230601)

從孟德爾的遺傳規(guī)律到Watson-Crick DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)，再到人類基因組計劃和植物基因組計劃的實施，其研究從細胞染色體水平深入到DNA大分子水平，再進入反向生物學(xué)階段。1920年，Winkles［1］提出了genome，由 gene和chromosomes兩個單詞組合而成，表明生物信息是由基因和染色體組成。隨著生物科學(xué)的迅速發(fā)展，生物學(xué)家們對基因組DNA研究的中心任務(wù)由一個或少數(shù)幾個基因逐步轉(zhuǎn)向整個基因組結(jié)構(gòu)以及功能的研究，基因組文庫應(yīng)運而生。通過幾十年的發(fā)展，基因組文庫為開展基因組的分化組成、基因的表達與調(diào)控、染色體區(qū)段的分子物理作圖等領(lǐng)域的研究和基因的克隆提供技術(shù)平臺。

1 基因組文庫的分類

基因組文庫種類繁多，按插入片段的大小可將其分為小于100Kb的小片段基因組文庫(cosmid、fosmid等)和100Kb及其以上的大片段基因組文庫(BAC、YAC等)。同時基因組文庫按其載體種類大致可分為噬菌體系列，如早期的λ噬菌體、cosmid、P1噬菌體和fosmid等;20世紀80年代起構(gòu)建的人工染色體系列，如YAC、BAC等，及在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的多元載體BIBAC和TAC。幾種克隆載體性質(zhì)的比較見表1。

2 噬菌體系列

2.1 λ噬菌體文庫

λ噬菌體是噬菌體改造成載體中應(yīng)用最為廣泛的，是基因組大小約49 Kb的線性雙鏈DNA噬菌體。DNA雙向復(fù)制機理的揭示、轉(zhuǎn)錄終止和抗終止作用蛋白質(zhì)的分離、DNA連接酶和促旋酶的發(fā)現(xiàn)和SOS修復(fù)機理的闡明等，都是以λ噬菌體為材料做出的重要成果。λ噬菌體是基因組文庫構(gòu)建中使用較早的載體，插入片段理論極限為23 Kb，雖容載有限，但為進一步構(gòu)建大片段插入文庫奠定了基礎(chǔ)，許多cDNA文庫也是以λ噬菌體作為克隆載體構(gòu)建的。例如，李南羿等以λGEM-11為載體構(gòu)建了草菇基因組文庫;張潔［2］等成功構(gòu)建重組率為100%的藜草花粉變應(yīng)原λ噬菌體cDNA表達文庫;朱靖［3］等針對λ噬菌體cDNA文庫效率低下、篩選等問題，利用λTripEx2噬菌體能自身環(huán)化成質(zhì)粒pTripEx2的原理將λ噬菌體cDNA文庫轉(zhuǎn)化成質(zhì)粒cDNA文庫;尚毅［4］等用液體分裝代替涂板分區(qū)改進了基于PCR的篩庫方法，提高了篩選速度和效率，實現(xiàn)了cDNA文庫的功能性篩選。

表1 克隆載體的種類及特點Table 1 The types and characteristics of the cloning vector

2.2 cosmid文庫

1978年，Collins等人構(gòu)建了柯斯質(zhì)粒載體，僅以λDNA兩端包裝噬菌體必需的cos序列，加上質(zhì)粒的復(fù)制序列、標志基因、多克隆位點等構(gòu)成，因此具有λ噬菌體和質(zhì)粒的特點，在宿主細胞內(nèi)以λ噬菌體DNA同樣的方式環(huán)化，與其他大腸桿菌宿主載體系統(tǒng)(BACs等)相比操作簡單［5］。Cosmid文庫插入片段極限可達45 Kb，已廣泛應(yīng)用于植物遺傳、基因克隆、測序和圖譜制作等研究中。彭開蔓和張啟發(fā)構(gòu)建了優(yōu)良水稻品種“明恢63”基因組的cosmid文庫;易厚富等構(gòu)建水稻廣親和品種核DNA cosmid文庫并分離得到一個位于水稻廣親和基因座S5附近的克隆R2I19;李敏等構(gòu)建了蜘蛛基因組DNA cosmid文庫并克隆了拖絲蛋白基因;安洋［6］等致力于研究紅色紅曲霉基因組cosmid文庫大片段DNA的制備;王雅麗［7］等構(gòu)建了小球藻南極株和溫帶株基因組的cosmid文庫。但cosmid和λ噬菌體文庫很難完成大量疊連序列的組裝及哺乳動物基因組物理圖譜的構(gòu)建，從而限制了它的應(yīng)用。

2.3 P1噬菌體文庫和PAC文庫

1990年能高效擴增較大基因組片段(90-100Kb)P1噬菌體文庫被研制出來［8］，P1噬菌體的生物學(xué)特性、與黏粒相似的原理、裝備的標記基因等輔助原件，使得文庫能涵蓋哺乳動物基因組。在P1噬菌體文庫的基礎(chǔ)上，1994年Ioannou等將噬菌體P1和F因子系統(tǒng)相結(jié)合構(gòu)建了PAC文庫。PAC文庫通過電激穿孔導(dǎo)入而非像P1噬菌體文庫一樣通過包裝或特異位點重組的方式導(dǎo)入大腸桿菌，其插入片段為100-300 Kb。P1噬菌體文庫與PAC文庫都沒有明顯的嵌合和缺失現(xiàn)象，有較高的遺傳穩(wěn)定性，能高效擴增，外源DNA易分離。Gingrich等構(gòu)建了人類第二條染色體的PAC文庫;日本水稻基因組計劃(RGP)已將水稻的PAC文庫用于物理圖譜的構(gòu)建［9］。

2.4 fosmind文庫

1992年，Kim等用 BAC載體的前體 pBAC引入pUCcos改造cosmid載體，使其成為能夠穩(wěn)定搭載大小約45 kb DNA片段的fosmid載體。Fosmid是現(xiàn)在流行的構(gòu)建文庫的新載體，構(gòu)建時不采用限制性酶切，從而避免了酶切位點的偏好性，拷貝數(shù)低且復(fù)制穩(wěn)定，插入片段大小適中，篩選方便等特點使得fosmid文庫廣泛地應(yīng)用于基因的位圖克隆、物理圖譜的構(gòu)建和比較基因組學(xué)中。近年來使用fosmid構(gòu)建文庫的研究不斷增多，如土壤環(huán)境;紅曲菌、鰻弧致病菌［10］等微生物;白菜［11］、對蝦［12］等動植物;Beta-Lactamase Gene、Opp 基因簇等具有研究意義的基因。樊帆［13］等基于Illumina公司的測序平臺，使用標簽和標簽接頭，成功構(gòu)建了高通量低成本的fosmid文庫;趙心清等通過構(gòu)建fosmid文庫篩選獲得一種海洋鏈霉菌鹵化酶基因及其修飾產(chǎn)物的生物合成基因簇。

3 人工染色體系列

3.1 YAC文庫

YAC是最早發(fā)展的真正意義上的人工染色體，插入片段理論上可達2 Mb左右，能覆蓋完整的基因組。YAC最初由Murray等人提出并首次構(gòu)建55 kb包括著絲粒、端粒、復(fù)制子和外源DNA的YAC，美國華盛頓大學(xué)Burke等人首先完成了人類基因組的YAC文庫。YAC簡化了構(gòu)建染色體延伸區(qū)域圖譜和分離完整基因的過程;能構(gòu)建大的人類基因區(qū)段;為真核生物DNA提供了更合適的環(huán)境，能夠克隆某些在細菌中不能克隆的DNA區(qū)段，是分離和制備人類染色體圖譜應(yīng)用最多的體系。人類已建成“百萬堿基級”YAC文庫，X、Y、21號染色體YAC文庫等，相繼獲得、分離和分析了乳腺癌基因、囊性纖維變性基因等人類基因。小鼠、擬南芥、水稻等模式生物YAC文庫已構(gòu)建和使用，番茄、桑蠶等經(jīng)濟作物和功能基因(免疫球蛋白k鏈基因)的YAC文庫已建立，還進一步對YAC本身進行改良研究［14］。

3.2 BAC文庫

1992年Shizuya等構(gòu)建了第一個BAC載體pBAC108L，開創(chuàng)了BAC文庫的紀元。BAC文庫插入片段約300 kb，轉(zhuǎn)化率高，遺傳穩(wěn)定，幾乎不存在嵌合現(xiàn)象等特點成為近幾年應(yīng)用最廣泛的大片段基因組文庫。多種植物(包括大多數(shù)重要農(nóng)作物)、微生物、動物甚至線粒體等細胞器的BAC文庫已構(gòu)建使用，從傳統(tǒng)的水稻、小鼠等模式生物到稀有的或有研究價值、經(jīng)濟價值的物種;從構(gòu)建整個基因組到對部分基因的深入探索，從水生到陸生，從簡單到復(fù)雜。如國內(nèi)外學(xué)者對揚子鱷、食蟹猴［15］、蕪菁［16］、鏈霉菌［17］等展開研究并獲得一定的成果。BAC對整個分子生物學(xué)的發(fā)展作出了巨大的貢獻，對基因克隆和基因資源的保存起著重要的作用，但是現(xiàn)在高通量測序技術(shù)降低了BAC文庫的利用率，夏正俊等建立了無網(wǎng)格BAC文庫及其陽性克隆篩選的方法，解決了現(xiàn)有無網(wǎng)格BAC文庫程序復(fù)雜、費時、假陽性等問題。高海燕等首次通過非暗培養(yǎng)構(gòu)建了棉花BAC文庫，簡化了構(gòu)建工序，節(jié)約了材料用量，這一方法適用于所有棉花種。

3.3 MAC文庫

哺乳動物人工染色體(MAC)的構(gòu)建和使用在多年前曾被認為是極端的理想主義，但YAC的研究成功及人類基因組YAC文庫的構(gòu)建，對構(gòu)建MAC是一個極大的鼓舞。MAC能容納大于1000 Kb的外源DNA，能為大而復(fù)雜的基因提供自主復(fù)制的轉(zhuǎn)移載體，甚至能精確提供有絲分裂和減數(shù)分裂所需的染色體，因此可用于哺乳動物細胞中染色體功能的研究和體細胞基因治療［18］。MAC的基本元件包括復(fù)制起點、端粒和著絲粒。哺乳動物染色體的復(fù)制起點不只一個，一條染色體上可能有多個復(fù)制起點，且長短不等，這些都增加了對其分離和結(jié)構(gòu)與功能研究的難度。端粒可能參與間期細胞核三維結(jié)構(gòu)的建成并保證染色體末端的穩(wěn)定復(fù)制，目前已被分離出。而著絲粒的分離要困難得多，著絲粒對于染色體在有絲分裂中的精確定位和分離起重要作用。人的著絲粒大且復(fù)雜，Y染色體著絲粒包括大量串聯(lián)重復(fù)的αDNA(24-1600 Kb)，兩側(cè)還排列著一些微衛(wèi)星和局部重復(fù)順序。近年來在闡明著絲粒功能，克隆著絲粒DNA以及分離跟著絲粒功能有關(guān)的蛋白等方面已經(jīng)取得了不少進展。

3.4 HAC文庫

HAC即人類人工染色體，第一個有絲分裂穩(wěn)定的人類人工染色體是由克隆的人類α衛(wèi)星DNA和端粒序列及其他基因組DNA轉(zhuǎn)染HT1080纖維肉瘤細胞獲得的。1998年Ikeno等人用構(gòu)建YAC的方法來構(gòu)建HAC:21號染色體上的100 Kb左右的人類I型α衛(wèi)星DNA(α-21-I)被克隆到Y(jié)AC載體并翻新了人類著絲粒的序列。HAC大小為1-5 Mb，原位雜交顯示插入環(huán)狀DNA發(fā)生多聚化是普遍的并確定HAC不需要宿主細胞末端著絲粒的DNA序列來促使游離基因修復(fù)成有絲分裂穩(wěn)定的DNA［19］。HAC在研究轉(zhuǎn)基因和基因組功能方面是潛力載體，在克隆、操縱和轉(zhuǎn)移大片段基因組時具有穩(wěn)定性，目前主要應(yīng)用于基因治療和干細胞研究。隨著人類人工染色體的發(fā)展，大片段基因組導(dǎo)入哺乳動物細胞仍被高分子DNA的制備和低拷貝新生HAC的結(jié)構(gòu)所限制。到目前為止，僅有少數(shù)報導(dǎo)過大片段基因組成功包裹進新生的HAC中。

4 第三代人工染色體

4.1 BIBAC文庫

1996年，Hamilton等結(jié)合BAC和根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的特點，構(gòu)建了一種能在大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌中穿梭復(fù)制的“雙元”BAC載體BIBAC。BIBAC具有植物選擇標記、能夠直接轉(zhuǎn)化植物、重組子篩選便利、轉(zhuǎn)化率和克隆效率較高。1999年Hamiton等構(gòu)建了西紅柿的BIBAC文庫，隨后擬南芥、藥用野生稻、香蕉等的BIBAC文庫也被相繼構(gòu)建，其克隆片段在不同農(nóng)桿菌中的遺傳穩(wěn)定性、載體DNA的高效制備等相關(guān)方面也有一定的研究。程在全［20］等發(fā)明了BIBAC基因文庫混合池及混合池和基因的快速篩選方法，并成功構(gòu)建水稻滲入系以便快速、準確的發(fā)掘優(yōu)良基因。

4.2 TAC文庫

劉耀光等人結(jié)合PAC和雙元載體的特點的建立起了可轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)TAC，構(gòu)建了pYLTAC7。在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來的系列載體如pYLTAC17以水稻肌動蛋白ActⅠ為強啟動子，bar基因為植物選擇標記基因，適合禾本科作物轉(zhuǎn)化體的選擇;pYLTAC27以Act iv為啟動子，hpt為篩選標記基因，可以高效應(yīng)用于單子葉植物的基因圖位克隆及功能分析。目前已經(jīng)構(gòu)建了擬南芥、水稻、金魚草、稻瘟菌［21］等的 TAC 文庫，并應(yīng)用TAC文庫分離及克隆出多個功能基因;或構(gòu)建同一種屬的不同物種的文庫來比較其基因差異并利用文庫研究資源的遺傳保護。

5 展望

基因組文庫是研究基因的重要工具及手段，克隆載體系統(tǒng)和基因組文庫的發(fā)展推動基因組學(xué)及相關(guān)學(xué)科如遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等的發(fā)展。質(zhì)粒和噬菌體文庫的產(chǎn)生和發(fā)展為后續(xù)人工染色體系列文庫的產(chǎn)生和發(fā)展奠定了基礎(chǔ);cosmid和fosmid文庫增加了容載大小;YAC文庫的產(chǎn)生不僅彌補了容量小的缺點，還解決了真核生物表達的許多問題;BAC文庫彌補了YAC文庫穩(wěn)定性差和嵌合現(xiàn)象，并以構(gòu)建方便和操作簡單成為了基因組研究應(yīng)用最廣泛、最主要的克隆工具;MAC和HAC文庫大片段轉(zhuǎn)化哺乳動物染色體的能力具有廣泛的研究前景;BIBAC和TAC文庫的發(fā)展，標志著基因多元化載體的研究，不僅加速了植物基因組研究、圖位克隆和功能分析，還對多基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的發(fā)展起了肯定的作用，對植物基因工程具有重要意義。多基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)將會成為今后基因工程的重點，未來是多基因工程的時代。

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