師存?zhèn)?，敬曉鵬，劉詠梅，冶占福，宋濤

（1.青海大學附屬醫(yī)院疼痛科，西寧 810001；2.沈陽市一五七醫(yī)院內(nèi)科，沈陽 110045；3.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院疼痛科，沈陽 110001）

目前，射頻治療廣泛應用于疼痛治療領(lǐng)域。治 療的疾病主要包括三叉神經(jīng)痛、枕大神經(jīng)痛、帶狀皰疹后神經(jīng)痛、脊神經(jīng)根性痛以及癌痛等，并取得了明確的臨床效果［1～4］。在疼痛治療中常用的射頻模式包括：脈沖射頻、連續(xù)射頻、雙極射頻等，其中連續(xù)射頻技術(shù)（continuous radiofrequency，CRF）與其他破壞感覺神經(jīng)傳導通路的方法相似。通過使射頻針尖周圍的靶組織凝固壞死而終止神經(jīng)信號的傳導［5］，在止痛的同時通常會造成相關(guān)區(qū)域的皮膚感覺減退，而出現(xiàn)麻木或蟻走感。而脈沖射頻（pulsed radiofrequency，PRF）在臨床治療中同樣具有止痛的效果，且不伴有皮膚感覺的減退，但其起效時間較連續(xù)射頻慢，同時療效維持時間也有待于深入觀察［6，7］。本研究比較CRF及PRF對大鼠坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)上的影響，探究PRF的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

50只雄性Wistar大鼠（青海大學醫(yī)學院實驗動物部提供），清潔級，體質(zhì)量180～220 g。

所有研究動物水、食物供應充足，生長室溫20～26℃，相對濕度55%±15%，無噪音、強光，晝夜節(jié)律正常的環(huán)境中。50只大鼠隨機分5組，每組10只。

1.2 處理方法

所有大鼠均給予氯胺酮（80 mg/kg）聯(lián)合甲苯噻嗪（25 mg/kg）腹腔注射麻醉后，沿右臀部做一斜切口，剝離肌肉，暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)（暴露范圍從坐骨切跡至脛、腓神經(jīng)分叉處）。需接受射頻處理的大鼠射頻針于脛、腓神經(jīng)分叉前插入坐骨神經(jīng)，選用美國施樂輝公司生產(chǎn)的PMG-230型射頻儀進行射頻處理。然后依次按如下方式處理大鼠：對照組，僅暴露神經(jīng)不做任何其他處理；假實驗組，脈沖電極針插入坐骨神經(jīng)120 s，但電極不通電。PRF-42℃組，按照2 Hz的脈沖射頻頻率，每次持續(xù)20 ms，處理時間120 s，溫度設定為42℃；CRF-42℃組，使用連續(xù)射頻的方式對坐骨神經(jīng)進行熱凝，處理時間120 s，溫度設定為42℃；CRF-70℃組，同樣使用連續(xù)射頻的方式對坐骨神經(jīng)進行熱凝，處理時間120 s，溫度設定為70℃。處理結(jié)束后，皮膚切口縫合。21 d后處死大鼠，取坐骨神經(jīng)組織做電子顯微鏡檢查。

1.3 電子顯微鏡檢查

組織標本用2.5%戊二醛固定6 h后，用磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）洗滌。再次于1%的四氧化鋨及戊二醛緩沖液（pH 7.4）中固定2 h，梯度乙醇脫水后，使用環(huán)氧丙烷洗滌，再以環(huán)氧樹脂包埋。用LKB-Nova V型超薄切片機（瑞典）做2 μm半薄切片，將半薄切片用亞甲藍染色，然后用尼康Eclipse600（日本尼康公司）光學顯微鏡進行觀察。對半薄切片進行修整和定位后做60 nm的超薄切片，并用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色5 min，然后用JEM 1200EX透射電鏡和Orius SC 1000型數(shù)字化相機（日本Jeol有限公司）進行電子顯微鏡觀察和照相。

1.4 數(shù)據(jù)分析

從每個樣本中隨機選取2張切片，每組10個樣本共20張切片，從每張切片內(nèi)選出10個髓鞘軸突進行觀察分析并分級。病理分級標準［8］：0級：正常結(jié)構(gòu)；1級：髓鞘結(jié)構(gòu)分層；2級：髓鞘結(jié)構(gòu)斷裂；3級：出現(xiàn)蜂巢樣結(jié)構(gòu)；4級：髓鞘崩解形成髓鞘球。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，行χ2檢驗，P＆lt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠電鏡觀察結(jié)果

實驗過程中無大鼠傷口感染、自殘、死亡事件發(fā)生。各組大鼠無髓鞘軸突超微結(jié)果未見明顯異常。對照組大鼠大部分的髓鞘軸突顯示正常（圖1）。假實驗組中大鼠大部分髓鞘軸突顯示正常，但小部分表現(xiàn)為磷脂脫落（圖2），這可能與研究過程中缺乏灌注有關(guān)。PRF-42℃組大鼠未發(fā)現(xiàn)存在嚴重變性的髓鞘軸突。大部分軸突僅表現(xiàn)為磷脂脫落，并且可同時觀察到新形成的髓鞘軸突（圖3）。CRF-42℃組大鼠約1/3的髓鞘軸突可以觀察到嚴重的變性（Wallerian變性）。這些變性的軸突可見髓鞘崩脫、形成髓鞘球，細胞骨架成絮狀或消失，線粒體膨脹或消失。損壞的軸突只存在電極作用部位，而遠離該處的組織中髓鞘軸突形態(tài)正常。該組同樣觀察到新形成的髓鞘軸突（圖4）。CRF-70℃組大鼠大部分髓鞘軸突可以觀察到嚴重的變性（Wallerian變性），同時可見髓鞘崩脫、形成髓鞘球，細胞骨架成絮狀或消失，線粒體膨脹或消失。該組大鼠所有的髓鞘軸突均遭到不同程度破壞，電鏡下所有的軸突均表現(xiàn)出病理改變（圖5）。

圖1 對照組電鏡下超微結(jié)構(gòu)觀察×6000Fig.1 Observation of ultrastructure under electron microscope inthe control group×6 000

圖2 假實驗組電鏡下超微結(jié)構(gòu)觀察（白色箭頭指示脫落的磷脂，黑色箭頭指示無髓鞘軸突）×6000Fig.2 Observation of ultrastructure under electron microscope inthe sham group （white arrow：loss of the phospholipids，black arrow：unmyelinated axon）×6 000

圖3 PRF-42℃組電鏡下超微結(jié)構(gòu)觀察（白色箭頭指示脫落的磷脂，黑色箭頭指示無髓鞘軸突）×6000Fig.3 Observation of ultrastructure under electron microscope inthe PRF-42 ℃ group （white arrow：loss of the phospholipids，black arrow：unmyelinated axon）×6000

圖4 CRF-42℃組電鏡下超微結(jié)構(gòu)觀察（白色箭頭指示髓鞘球，黑色箭頭指示腫脹的線粒體）×6000Fig.4 Observation of ultrastructure under electron microscope inthe CRF-42 ℃ group（white arrow：ovoid myelin，black arrow：swollen mitochondria）×6000

2.2 各組分級情況比較

圖5 CRF-70℃組電鏡下超微結(jié)構(gòu)觀察（白色箭頭指示髓鞘球，黑色箭頭指示腫脹的線粒體）×6000Fig.5 Observation of ultrastructure under electron microscope inthe CRF-70 ℃ group （white arrow：ovoid myelin，black arrow：swollen mitochondria）×6000

對照組及假實驗組未觀察到2～4級變性，PRF-42℃組展示較好的分級情況，而CRF-70℃組分級情況最差。所有實驗組與對照組比較分級均有統(tǒng)計學差異（P＆lt;0.05）。而且PRF-42℃組、CRF-42℃組、CRF-70℃組3組間兩兩比較差異也有統(tǒng)計學意義（P＆lt;0.05），見表1。

3 討論

CRF探針溫度一般設定為60～80℃，這可造成靶組織的凝固性壞死。因此，CRF可以有效破壞選擇區(qū)域的神經(jīng)，造成持續(xù)的真皮區(qū)域的感覺遲鈍而產(chǎn)生長久的止痛效果。PRF被認為是一種溫和而安全的射頻技術(shù)，與CRF比較PRF對周圍組織及神經(jīng)的損傷較輕［9］。而 Van Zundert等［10］的研究發(fā)現(xiàn)，慢性盆腔疼痛、慢性三叉神經(jīng)疼痛患者行PRF治療后未發(fā)現(xiàn)明確不良反應。何云武等［11］分析了24例腰椎間盤突出患者行PRF的治療效果，發(fā)現(xiàn)PRF治療與常規(guī)治療比較可以顯著降低患者術(shù)后1周、1個月及3個月的疼痛評分，制痛效果明顯。

以往認為射頻電流只對小的無髓神經(jīng)纖維有影響。而Kanpolat等［12］認為CRF的止痛作用是通過破壞有髓神經(jīng)及無髓神經(jīng)纖維實現(xiàn)的。本研究發(fā)現(xiàn)CRF及PRF均不會造成無髓神經(jīng)纖維的損害，而CRF-42℃可造成約1/3的髓鞘軸突可以觀察到嚴重的變性，造成軸突的髓鞘崩脫、形成髓鞘球，細胞骨架成絮狀或消失，線粒體膨脹或消失。隨著CRF溫度升高，70℃時大部分髓鞘軸突可以觀察到嚴重變性，并且神經(jīng)及其周圍組織均有不同程度損害。說明CRF的止痛作用與有髓神經(jīng)纖維的損害有關(guān)。然而脈沖射頻治療疼痛的機制至今尚未完全闡明。國外學者［7］認為PRF止痛的機制可能與其在神經(jīng)組織間形成的電動勢有關(guān)，這可以造成諸如質(zhì)膜破壞、影響細胞主要功能的分子鏈破壞等細胞結(jié)構(gòu)的改變。本研中PRF-42℃與CRF-42℃神經(jīng)病變的分級存在明顯差異，前者顯著低于后者，并且超微結(jié)構(gòu)的改變更加輕微。再次說明PRF的止痛作用與熱效應關(guān)系不大。而本研究中PRF組僅觀察到有髓神經(jīng)纖維磷脂的脫落，推測其鎮(zhèn)痛作用可能與此有關(guān)。因為髓鞘的脫落可造成神經(jīng)傳導阻斷，進而發(fā)揮止痛作用。而磷脂層的脫落可能與電磁場對細胞膜的作用有關(guān)。

表1 各組超微結(jié)構(gòu)分級情況Tab.1 Grading scores of ultrastructure in different groups

綜上所述，脈沖射頻時的高頻電磁場可能導致可逆性的磷脂脫落；而有髓神經(jīng)纖維磷脂脫落則可能阻斷神經(jīng)沖動的傳導，發(fā)揮鎮(zhèn)痛效果。PRF的止痛機制可能與熱作用無關(guān)。本研究觀察了不同射頻參數(shù)對正常神經(jīng)纖維超微結(jié)構(gòu)的影響，并結(jié)合臨床現(xiàn)象進行初步的分析，為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。今后可以通過建立不同機制的疼痛模型，研究射頻對病理狀態(tài)下的神經(jīng)纖維超微結(jié)構(gòu)的影響及相關(guān)的動物行為學變化。另外在臨床上，以“神經(jīng)節(jié)”和“神經(jīng)纖維”不同部位為靶點進行的射頻治療具有不同的臨床效果，今后可以對“神經(jīng)節(jié)”及“神經(jīng)纖維”等不同部位的射頻治療進行比較，深入探討射頻在疼痛治療中的機制。

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