李 娜，楊 鷹，萬(wàn) 潔，韋雷飛，鐘金城*，武志娟，姜雪鷗，張利亞

(1.動(dòng)物遺傳育種學(xué)國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南民族大學(xué)，四川 成都 610041；2攀枝花市農(nóng)林科學(xué)研究院，四川 攀枝花 617061)

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)標(biāo)記技術(shù)是由荷蘭科學(xué)家Zabeau和Vos在PCR和RFLP技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種DNA多態(tài)檢測(cè)方法[1]。AFLP具有多態(tài)性豐富，可靠性好，分辨率高，方便快速等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于植物(小麥、水稻、擬南芥等)遺傳育種研究中，在動(dòng)物和微生物遺傳育種研究中也有一些應(yīng)用。Kim[2]等利用AFLP標(biāo)記和表型分類法對(duì)海膽屬的動(dòng)物進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)海膽屬內(nèi)親緣關(guān)系較近，種群間遺傳距離為種內(nèi)的3倍。Jeremy等[3]結(jié)合微衛(wèi)星和AFLP標(biāo)記構(gòu)建5種羅非魚(yú)-Oreochromis niloticus [wild type(on)和 red (Ron) strains]、O. aureus(Oa)、O. msambicus(Om)、Sarotherod on galilaeus(Sg)合成群體的遺傳圖譜，此圖譜在培育羅非魚(yú)時(shí)跟蹤耐寒、耐鹽及魚(yú)體質(zhì)量等數(shù)量性狀位點(diǎn)的變動(dòng)，在分子水平標(biāo)記起關(guān)鍵作用。因而AFLP在構(gòu)建物種分子遺傳圖譜，種質(zhì)資源鑒定，遺傳多樣性研究等方面意義顯著。

我國(guó)黑山羊主要分布在海拔2 500 m以下、氣候溫暖、雨水充分的地區(qū)。黑山羊產(chǎn)肉性能好，繁殖率高，生長(zhǎng)發(fā)育快，養(yǎng)殖前景優(yōu)良。四川省攀枝花市及周邊地區(qū)黑山羊品種豐富，之前的研究主要以生產(chǎn)性能方面為主，很少在DNA分子水平上展開(kāi)。本研究采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)分析該地區(qū)及周邊黑山羊品種(群體)的遺傳多樣性，以期為該地區(qū)黑山羊品種的進(jìn)一步選育、保種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

本試驗(yàn)選取攀枝花市的米易(MY，n=15)、鹽邊(YB,n=15)、龍?zhí)?LT,n=11)、中壩(ZB,n=4)，以及周邊地區(qū)的云嶺(YL,n=40)、樂(lè)至(LZ,n=20)、金堂(JT,n=20)、會(huì)理(HL,n=40)、建昌(JT,n=20)等5個(gè)黑山羊品種(類群)，共185個(gè)健康個(gè)體(表1)。頸靜脈采血，抗凝處理，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 DNA提取

表1 接頭、預(yù)擴(kuò)增與選擇性擴(kuò)增引物序列Table 1 Adapters and primer sequences used for pre-amplification and selective amplification

基因組DNA提取參照《分子克隆指南》(第三版)(上冊(cè))哺乳動(dòng)物DNA的快速分離法[4]，所提取DNA置于-20 ℃冰箱保存。

1.3 AFLP分析

AFLP方法參照相關(guān)文獻(xiàn)[5-9]，并作少許修改。

1.3.1 酶切 0.5 μLMseI、0.5 μLEcoRI、4 μL 10Х酶切緩沖液、10 μL基因組DNA、加去離子水至40 μL，37 ℃酶切3 h，70 ℃滅活15 min。

1.3.2 連接 取酶切產(chǎn)物10 μL、1 μLMseI接頭、1 μLEcoRI接頭、1 μL T4-連接酶、2 μL buffer、5 μL ddH2O，16 ℃過(guò)夜，70 ℃滅活10 min，將連接產(chǎn)物置于-20 ℃冰箱,備用。連接接頭為E，M(表1)。

1.3.3 預(yù)擴(kuò)增 將1 μL連接產(chǎn)物、1 μL Primer Ep、0.1 μL Primer Mp、12.5 μL mastermix、6.4 μL ddH2O混合離心后, 進(jìn)行PCR反應(yīng)(94 ℃預(yù)變性 3 min, 94 ℃變性45 s, 56 ℃退火60 s, 72 ℃延伸80 s, 共 30～35個(gè)循環(huán), 最后延伸10 min，4 ℃保存)，用0.5 %瓊脂糖電泳觀察結(jié)果。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋30倍，置于-20 ℃溫度下，備用。須擴(kuò)增引物為E0、M0(表1)。

1.3.4 選擇性擴(kuò)增 將1 μL稀釋后預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物、1 μL Primer E、0.16 μL Primer、12.5 μL M mastermix、10.34 μL ddH2O混合離心后, 進(jìn)行PCR反應(yīng)(94 ℃變性30 s, 56 ℃退火60 s, 72 ℃延伸60 s, 共15～20個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)溫度降低0.7 ℃，然后再90 ℃變性，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，持續(xù)23個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min)。選擇性擴(kuò)增引物為E1～E6，M1～M6(表1)。

1.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果

預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物用5%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，每個(gè)泳道點(diǎn)樣2 μL，200 V預(yù)電泳5 min，85 V電泳1 h，0.2%硝酸銀溶液染色，甲醛氫氧化鈉顯色液顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

1.5.1 條帶記錄 根據(jù)各樣本AFLP標(biāo)記結(jié)果，選取清晰且重復(fù)性好的條帶，清晰可重復(fù)的記為“1”，否則記為“0”。

1.5.2 多態(tài)性與遺傳多樣性指數(shù)計(jì)算 根據(jù)所記錄的 “0,1”矩陣，利用POPGENE和DCFA軟件統(tǒng)計(jì)群體多態(tài)標(biāo)記數(shù)、多態(tài)頻率遺傳多樣性指數(shù)Shannon。

1.5.3 遺傳距離的計(jì)算 根據(jù)條帶的“0,1”矩陣，利用POPGENE和DCFA軟件統(tǒng)計(jì)遺傳距離。

1.5.4 聚類分析 根據(jù)遺傳距離，利用Mega5.0軟件，采用算術(shù)平均的非加權(quán)組對(duì)法(Unweighted Paie-Group Method with Arithmetic Averaging,UPGMA)和鄰接法(Neighbor-Joining Method, NJ)構(gòu)建群體系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFLP擴(kuò)增結(jié)果

15對(duì)AFLP引物擴(kuò)增結(jié)果表明：多態(tài)頻率范圍為93.33%～100%，平均值99.01%，共擴(kuò)增出1 011個(gè)條帶，其中多態(tài)條帶1 003個(gè)，不同引物組合擴(kuò)增條帶不同(表2、圖1)。

引物組合E2-M1、E2-M3、E2-M4、E5-M3、E3-M2、E5-M1擴(kuò)增條帶較多，平均擴(kuò)增條帶數(shù)分別為41、38、38、30、30、29，AFLP多態(tài)性豐富。攀枝花本地黑山羊擴(kuò)增多態(tài)條帶最多，多態(tài)位點(diǎn)頻率為85.42%，建昌黑山羊次之，樂(lè)至黑山羊最少，多態(tài)位點(diǎn)頻率為25.99%，5個(gè)群體平均多態(tài)頻率為42.54%(表3)，表明這些黑山羊群體具有較豐富的遺傳多樣性。

2.2 遺傳多樣性指數(shù)

M.100 bp DNA Marker,1-9.依次表示選擇性引物組合E2-M3、E2-M4、E2-M5、E2-M6、E3-M4、E3-M5、E3-M6、E4-M1、E5-M1對(duì)攀枝花龍?zhí)?號(hào)個(gè)體DNA限制性片段擴(kuò)增的電泳圖譜

M.100 bp DNA Marker，1-9 stand for AFLP electrophorsis bands of restrict fragment of black goat LT2 by selective primer combinations E2-M3、E2-M4、E2-M5、E2-M6、E3-M4、E3-M5、E3-M6、E4-M1、E5-M1 correspondingly.

5個(gè)黑山羊群體的遺傳多樣性指數(shù)變異范圍為0.0286～0.2131，表明這些黑山羊群體具有較豐富的遺傳多樣性(表4)。平均遺傳多樣性指數(shù)依次為建昌黑山羊(0.1346)>攀枝花黑山羊(0.1329)>金堂黑山羊(0.1230)>云嶺黑山羊(0.1201)>樂(lè)至黑山羊(0.1101)，說(shuō)明建昌黑山羊遺傳多樣性最高，攀枝花黑山羊次之，樂(lè)至黑山羊遺傳多樣性最低。

2.3 遺傳距離

5個(gè)群體中，群體間遺傳距離范圍為0.0062～0.0281，攀枝花與建昌之間的遺傳距離最小(DR=0.0062),云嶺與攀枝花間的遺傳距離次之(DR=0.0128)，樂(lè)至與金堂間遺傳距離最大(DR=0.0281)，金堂與其它4個(gè)類群遺傳距離較大(DR=0.0173-0.0281)(表5)。說(shuō)明攀枝花與建昌的親緣關(guān)系最近，云嶺與攀枝花親緣關(guān)系較近，樂(lè)至與金堂的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，金堂與其它4個(gè)類群遺傳距離均比較遠(yuǎn)。

2.4 聚類分析

表2 選擇性引物及5個(gè)群體的AFLP擴(kuò)增結(jié)果Table 2 The selective primers and the result of AFLP among 5 black goat populations

根據(jù)遺傳距離，采用UPGMA法和NJ法構(gòu)建遺傳系統(tǒng)樹(shù)狀圖， 攀枝花與建昌聚為一類，攀枝花，建昌與云嶺、樂(lè)至聚為一類，金堂與其它4個(gè)親緣關(guān)系均比較遠(yuǎn)，兩種聚類方法所得結(jié)果基本一致(圖2、圖3)，說(shuō)明聚類結(jié)果的精確性。

3 討 論

3.1 攀西黑山羊的AFLP遺傳多樣性

AFLP標(biāo)記技術(shù)采用不同類型限制性內(nèi)切酶和不同數(shù)目選擇性堿基，理論上可產(chǎn)生無(wú)限多標(biāo)記數(shù)，并且覆蓋整個(gè)基因組，被認(rèn)為是指紋圖譜中多態(tài)性最豐富的一項(xiàng)技術(shù)，目前常用的限制性內(nèi)切酶組合是EcoRI和MseI[5-6]。

茍本富等[11]研究了AFLP在檢測(cè)小香羊遺傳多樣性方面應(yīng)用的可行性，用PstI酶切，10條引物共獲得113條AFLP標(biāo)記，群體相似系數(shù)為0.913(0.814-0.980)，為小香羊的遺傳穩(wěn)定性提供了相關(guān)參數(shù)。本研究用15對(duì)引物對(duì)5個(gè)群體進(jìn)行AFLP標(biāo)記，共擴(kuò)增出1 011個(gè)條帶、1 003個(gè)多態(tài)條帶，平均多態(tài)頻率為99.01%，表明黑山羊群體間和群體內(nèi)遺傳多樣性豐富。建昌遺傳多樣性最高，其次是攀枝花、金堂、云嶺黑山羊，樂(lè)至黑山羊遺傳多樣性最低，說(shuō)明建昌、攀枝花本地黑山羊遺傳純度較低，樂(lè)至黑山羊遺傳變異純度低，種質(zhì)均勻性好，遺傳純度高。建昌黑山羊遺傳多樣性結(jié)果與李利等[14]的結(jié)果不一致，原因可能是所用分析方法不同。

表3 5個(gè)黑山羊群體的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)及多態(tài)頻率Table 3 The number of polymorphic loci and polymorphic frequence among 5 black goat populations

表4 5個(gè)黑山羊群體遺傳多樣性指數(shù)Table 4 The genetic diversity index of 5 black goat populations

表5 5個(gè)黑山羊群體的遺傳距離Table 5 The genetic distance of 5 black goat populations

圖2 5個(gè)黑山羊群體遺傳距離的UPGMA聚類關(guān)系Fig.2 The cluster of 5 black goat populations based on UPGMA

圖3 5個(gè)黑山羊群體遺傳距離的NJ聚類關(guān)系Fig.3 The cluster of 5 black goat populations based on NJ

曹少先[12]等用AFLP標(biāo)記對(duì)波爾山羊、徐匯山羊和海門山羊進(jìn)行多樣性分析，徐淮山羊與海門山羊具有最近的親緣關(guān)系，而波爾山羊與徐淮山羊的親緣關(guān)系較波爾山羊與海門山羊的親緣關(guān)系近。肖非[13]等對(duì)新疆6個(gè)綿羊品種進(jìn)行AFLP分析，所得遺傳相似系數(shù)和聚類結(jié)果與各綿羊品種的地理分布及現(xiàn)實(shí)狀況相吻合。本研究結(jié)果：PZH與JC聚為一類，PZH，JC與YL、LZ聚為一類， JT與其它4個(gè)親緣關(guān)系均比較遠(yuǎn)。其中LZ和JT間遺傳距離較小，與王杰等[7]的結(jié)果一致。會(huì)理縣距離攀枝花市較近，位于攀枝花市東北方；龍?zhí)多l(xiāng)與中壩鄉(xiāng)距離較近，位于攀枝花市以南；云南云嶺黑山羊分布較接近攀枝花市；金堂縣所處位置最遠(yuǎn)，說(shuō)明分類結(jié)果與群體地理分布、生態(tài)條件基本一致。

3.2 攀枝花市黑山羊資源的保護(hù)與利用

家畜遺傳資源是畜牧業(yè)生產(chǎn)的工具，對(duì)其進(jìn)行調(diào)查、正確分類有助于家畜資源的合理開(kāi)發(fā)利用。四川各地黑山羊生產(chǎn)性能及遺傳特征的研究，為各地黑山羊品種鑒定提供科學(xué)依據(jù)，也為黑山羊的選育、保種及開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)[15]。攀西地區(qū)擁有豐富的黑山羊種質(zhì)資源，通過(guò)AFLP標(biāo)記技術(shù)對(duì)攀枝花本地、云嶺、樂(lè)至、金堂、建昌5個(gè)黑山羊群體進(jìn)行研究，結(jié)果表明黑山羊品種間和群體內(nèi)遺傳多樣性豐富，為攀枝花市本地黑山羊品種的鑒定和更好地開(kāi)發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

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