王 崇，劉曉莉，史杰萍，吳燕華，王詩鑌，于雅琴，孫 輝

（1.吉林大學公共衛(wèi)生學院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學教研室，吉林 長春 130021；2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院甲狀腺外科，吉林 長春 130033）

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，占機體所有惡性腫瘤的1%［1］，其主要包括乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）、髓 樣 癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）、濾泡狀癌和未分化癌4種類型，其中以PTC最為常見［2］。甲狀腺癌的發(fā)病機制至今尚未完全明確，有研究［3］表明：女性、亞洲人種、學歷高、有甲狀腺腫病史、頸部接受過放射線照射和有甲狀腺疾病家族史是甲狀腺癌的危險因素。也有研究表明：甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展與某些基因及其基因的多態(tài)性有關(guān)，如RET原癌基因、TSHR基因、BARF基因和Ras基因等。L?nn等［4］和Ho等［5］已報道過 RET 基因多態(tài)性與PTC的發(fā)生有關(guān)。本研究采用病例對照的方法，通過檢測RET基因外顯子11上的rs1799939位點的基因多態(tài)性，探討該單核苷酸多態(tài)性（SNPs）位點與PTC的關(guān)聯(lián)性，為今后揭示甲狀腺癌的發(fā)病機制提供一定的遺傳學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2010年1—5月在吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院通過手術(shù)后病理切片確診的100例PTC患者作為病例組，按年齡、性別、民族和地理位置匹配，選取同期在吉林大學第一醫(yī)院進行體檢的100例排除腫瘤及甲狀腺相關(guān)疾病的健康人為對照組。研究對象均為中國北方漢族人群。所有PTC均依據(jù)《2009年美國甲狀腺學會甲狀腺結(jié)節(jié)和分化型甲狀腺癌診斷治療指南》確診。

1.2 標本的采集及處理 在獲取研究對象的知情同意后，抽取外周靜脈血5mL，EDTA抗凝，－20℃凍存以備基因組DNA的提取。

1.3 基因組DNA的提取 利用微量DNA提取試劑盒（Promega公司，美國）提取DNA，采用紫外分光光度計（Beckman公司，美國）檢測DNA含量，測定吸光度（A）值，A260／A280比值為1.6～2.0，提取出的DNA置于4℃冰箱保存。

1.4 引物設(shè)計 在NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫里下載RET基因rs1799939位點的模板序列，利用Primer Premier 5.0軟件，按照引物設(shè)計原則設(shè)計1對引物。上游引物：5′－CACAAGCCACCCATCTCC－3′，下游引物：5′－GAACGGCACCTCATCATAGTC－3′，PCR產(chǎn)物片段長度為342bp。

1.5 基因型檢測 采用PCR－RFLP方法進行基因型檢測：①PCR反應體系及條件。反應體系為25μL，含有2×Tag混合DNA聚合酶（北京天根生物公司）12.5μL（0.1U），上、下游引物（大連寶生物公司）各1.0μL（10μmol·L－1），ddH2O（二餾滅菌水）8.5μL，模板DNA（25～35ng）2.0μL。反應條件：94℃預變性5min，94℃變性40s，58.3℃退火1min，72℃延伸1min，40個循環(huán)后72℃延伸10min。取PCR產(chǎn)物6μL，用1%瓊脂糖凝膠電泳30min，電泳后用凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio－Rad公司，美國）進行照相和保存。②酶切體系及反應條件。利用限制性內(nèi)切酶BanⅠ對PCR擴增產(chǎn)物進行酶切。酶切體系為20μL，包括PCR擴增產(chǎn)物10μL，限制性內(nèi)切酶BanⅠ1.0μL，10×Buffer 2.0μL，ddH2O 7.0μL。酶切體系在37℃恒溫箱中酶切4～5h后，用2.5%瓊脂糖凝膠電泳45min，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察酶切圖譜，判斷位點的基因型并照相保存。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，應用擬合優(yōu)度χ2檢驗分析病例組和對照組基因型分布是否符合Hardy－Weinberg平衡定律，以及該位點的基因型、等位基因頻數(shù)分布與PTC的關(guān)聯(lián)。

2 結(jié) 果

2.1 2組研究對象的基本情況 病例組100例，其中男性24例，女性76例，平均年齡為（42.02±8.96）歲。對照組100例，其中男性26例，女性74例，平均年齡為（43.03±10.12）歲，病例組和對照組的年齡、性別差異均無統(tǒng)計學意義（t＝0.747，P＝0.456；χ2＝0.107，P＝0.744），具有可比性。

2.2 PCR擴增和酶切結(jié)果 RET基因上rs1799939位點是呈二態(tài)性的SNP位點，有G和A 2種等位基因。PCR擴增產(chǎn)物基因片段長度為342bp。見圖1。PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶BanⅠ消化后，可能產(chǎn)生2個酶切片段，長度分別為80和262bp。本研究檢測出2種基因型，分別為G／G基因型（純合切開）和G／A基因型（雜合切開），未發(fā)現(xiàn)A／A基因型（純合未切開）。見圖2。

2.3 Hardy－Weinberg遺傳平衡檢驗 經(jīng)擬合優(yōu)度χ2檢驗，該位點病例組和對照組的基因型頻數(shù)分布均符合 Hardy－Weinberg遺傳平衡定律（P＞0.05）。見表1。

圖1 rs1799939位點PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 The electrophoregram of PCR amplification products of rs1799939site

圖2 rs1799939位點限制性酶切產(chǎn)物電泳圖Fig.2 The electrophoregram of RFLP products of rs1799939site

2.4 rs1799939位點與PTC的關(guān)聯(lián)性分析 病例組和對照組G／G、G／A 2種基因型頻數(shù)分布差異無統(tǒng)計學意義（χ2＝0.276，P＝0.599），G、A等位基因頻數(shù)分布差異亦無統(tǒng)計學意義（χ2＝0.245，P＝0.621），ORGA／GG＝1.202（95%CI：0.604～2.393），ORA／G＝1.177（95%CI：0.616～2.250），rs1799939位點的多態(tài)性與PTC不存在關(guān)聯(lián)。見表2。

表1 rs1799939位點的Hardy－Weinberg遺傳平衡定律檢驗Tab.1 The goodness of fit chi－square test for the Hardy－Weinberg equilibrium of rs1799939site

2.5 rs1799939位點在不同性別PTC患者中的分布 按性別將病例組PTC患者分為男性、女性2組，進行基因型頻數(shù)和等位基因頻數(shù)的χ2檢驗，經(jīng)檢驗，不同性別的PTC患者在rs1799939位點的基因型頻數(shù)分布差異無統(tǒng)計學意義（χ2＝0.025，P＝0.874），G、A等位基因頻數(shù)分布差異亦無統(tǒng)計學意義（χ2＝0.022，P＝0.882）。見表3。

表2 rs1999939位點基因型和等位基因頻數(shù)分布Tab.2 Distribution of genotypic and allelic frequencies of rs1799939site ［n（η／%）］

表3 不同性別PTC患者基因型和等位基因頻數(shù)分布Tab.3 Distribution of genotypic and allelic frequencies in PTC patients with different genders ［n（η／%）］

3 討 論

近年來甲狀腺癌的發(fā)病率呈增高趨勢，世界各地女性患者的發(fā)病率均高于男性。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究署（IARC，http：／／www.iarc.fr／）［6］報道，全球男性甲狀腺癌發(fā)病率由2000年的1.2／10萬增加到2008年的1.5／10萬，女性由3.0／10萬增加到4.7／10萬，呈現(xiàn)逐年上升趨勢。我國天津、上海、海門等城市的流行病學調(diào)查也顯示甲狀腺癌的發(fā)病率逐年增高［7－9］。

RET原癌基因最先由Takahashi等［10］發(fā)現(xiàn)。該基因位于人類染色體10q11.2，共含有21個外顯子，全長60000bp，能夠編碼一種跨膜的酪氨酸激酶受體蛋白（RET蛋白），這種受體在神經(jīng)嵴細胞系中表達，對細胞的正常生理功能有調(diào)節(jié)作用，同時該蛋白也與細胞之間的信號轉(zhuǎn)導有關(guān)。目前國外已有研究報道RET基因多態(tài)性與甲狀腺癌的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)。L?nn等［4］研究表明：RET基因rs1799939位點的多態(tài)性與PTC的發(fā)生有關(guān)，且這種關(guān)聯(lián)性在年輕女性中表現(xiàn)更強。Elisei等［11］通過對106例健康人和106例MTC患者rs1799939位點基因型的檢測發(fā)現(xiàn)MTC的發(fā)生與該位點存在關(guān)聯(lián)性。2012年，F(xiàn)iglioli等［12］采用 Meta分析的方法也證實了rs1799939位點的多態(tài)性可以增加患甲狀腺癌的風險。國內(nèi)此類研究則較少。

本研究采用病例－對照研究方法，利用PCR－RFLP技術(shù)探討RET基因第11外顯子上rs1799939位點多態(tài)性與PTC的關(guān)系。分析結(jié)果表明：該位點的基因多態(tài)性與PTC的發(fā)生不存在關(guān)聯(lián)，與不同性別的PTC患者的發(fā)病也不存在關(guān)聯(lián)。這個結(jié)果與Ho等［5］的研究結(jié)果一致。本研究得到陰性結(jié)果的可能原因是：①樣本量較小，選取位點單一，能夠提供的信息量有一定限制，不足以得出有統(tǒng)計學意義的結(jié)果。有研究［13－14］表明：多個多態(tài)性位點聯(lián)合作用時可以增加甲狀腺癌的發(fā)病風險。②甲狀腺癌的病因很多，可能在發(fā)病的過程中有多個基因聯(lián)合作用，而每個基因所起的作用相對微小，因此在檢驗單個RET基因與甲狀腺癌的關(guān)系時可能難以達到顯著性水平。③甲狀腺癌的發(fā)病機制尚未清楚，除了已知的RAF／MEK／ERK信號轉(zhuǎn)導通路和PI3K／Akt信號轉(zhuǎn)導通路外，可能還存在其他未知的通路起著重要的作用。④甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展除了遺傳因素外，還與環(huán)境因素有關(guān)，本研究未探討環(huán)境因素的作用，可能會導致陰性結(jié)果。⑤由于本研究的研究對象與陽性結(jié)果的研究對象在地理位置、遺傳背景、種族和生活環(huán)境等方面存在差異，也有得到陰性結(jié)果的可能。⑥本研究病例組的癌癥病理類型為PTC，可能會與部分研究結(jié)果不一致。

綜上所述，本研究雖未發(fā)現(xiàn)rs1799939位點的多態(tài)性與中國北方漢族人群PTC的易感性存在關(guān)聯(lián)，但尚不能完全排除rs1799939位點在PTC發(fā)生中的作用。在今后的研究中，為了獲得更為準確的結(jié)果，可以擴大研究的樣本量，增加研究的多態(tài)性位點，同時檢測多個與甲狀腺癌的發(fā)生可能有關(guān)的基因，對相關(guān)資料進行單倍體型分析、基因－基因的交互作用分析、基因－環(huán)境的交互作用分析，進一步探討甲狀腺癌的發(fā)病機制。

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