顧延會(huì)，歐陽(yáng)瑤，孫得勝（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸一科，貴州 遵義 563003）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是氣道慢性非特異性炎癥性疾病。研究認(rèn)為多種細(xì)胞因子、趨化因子、蛋白酶和氧化劑等參與COPD炎癥過(guò)程。CC亞族趨 化 因 子 配 體 20（CC chemokine ligand－20，CCL20）是CC家族的趨化因子，主要表達(dá)于炎癥組織上皮表面，包括氣道上皮。國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道中均提示樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）參與COPD發(fā)病過(guò)程，作為DCs最強(qiáng)有力的趨化因子——CCL20亦可能參與了COPD的發(fā)病過(guò)程，可能是通過(guò)影響DCs在氣道內(nèi)的募集而參與該過(guò)程。本研究制備CCL20抑制型大鼠模型，研究CCL20和DCs在COPD發(fā)病過(guò)程中的作用及抗CCL20抗體治療對(duì)外周血和肺泡灌洗液（brochoalveolar lavage fluid，BALF）中 DCs表面因子表達(dá)的影響，以期進(jìn)一步認(rèn)識(shí)CCL20在COPD發(fā)病機(jī)制中的作用，從而為COPD的治療提供一個(gè)新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料與儀器 雄性SPF級(jí)Wistar大鼠（由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）48只，約8周齡，體質(zhì)量（200±20）g；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）及E.coli 055∶B5購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；MIP－3α（G－20）購(gòu)自Santa公司；大鼠巨噬細(xì)胞炎性蛋白3α（MIP－3α／CCL20）酶聯(lián)免疫分析試劑盒由美國(guó)B＆D公司生產(chǎn)，上海西塘生物科技有限公司提供；PE anti－rat CD80（B7－1）、 PE Mouse IgG1、k Isotype control、FITC anti－rat CD86（B7－2）、FITC Mouse IgG1、APC anti－rat MHC ClassⅡ及APC Mouse IgG1均購(gòu)自eBioscience公司；Anti－OX－62Monoclonal Antibody、 Mouse IgG1k Isotype control PE均購(gòu)自Thermo Science公司；Monoclonal Anti－rat CCL20／MIP－3α Antibody 購(gòu)自R＆D Systems公司。流式細(xì)胞檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)B＆D公司。

1.2 動(dòng)物分組及模型制備 48只 Wistar大鼠飼養(yǎng)于遵義醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室動(dòng)物房?jī)?nèi)（符合飼育SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物），飼養(yǎng)溫度25℃，相對(duì)濕度70%，晝夜照明12h／12h。按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組（n＝16）、COPD模型組（n＝16）和CCL20抑制組（n＝16）。參考文獻(xiàn)［1］制備動(dòng)物模型，COPD模型組及CCL20抑制組大鼠第1和15天氣道內(nèi)注入LPS溶液0.2mL（200μg／200μL），第2～28天（第15天除外）連續(xù)每天被動(dòng)吸煙2次，30min×12支／次；另外，CCL20抑制組大鼠第1天注LPS前腹腔注射CCL20單克隆抗體［2］（100μg／只）；正常對(duì)照組大鼠正常喂養(yǎng)，不加任何干預(yù)措施。各組大鼠于第28天，清醒狀態(tài)下，取內(nèi)毗球后靜脈叢血液1mL置于EDTA抗凝管，即為外周血標(biāo)本；開胸后立即結(jié)扎右肺，取右肺下葉組織約1cm×1cm×1cm大小用于病理切片；左肺經(jīng)支氣管肺泡灌洗留取BALF。

1.3 ELISA法檢測(cè)血清上清液和BALF中CCL20含量 應(yīng)用ELISA法測(cè)定血清和BALF中CCL20含量，測(cè)定方法按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)血漿和BALF中DCs表面因子CD80、CD86、OX－62及MHC－Ⅱ的表達(dá)血漿和BALF標(biāo)本加熒光抗體，室溫避光25min，PBS漂洗2次，加固定液至200μL，上機(jī)。FCM測(cè)定由遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院細(xì)胞工程室專人操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)均以表示。外周血和BALF中CD80、CD86、OX－62和CCL20含量及外周血MHC－Ⅱ表達(dá)水平3組間比較均采用單因素方差分析（One－way ANOVA）。外周血中CCL20、CD80、CD86、OX－62和MHC－Ⅱ表達(dá)水平及BALF中CCL20含量3組間方差齊，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)；BALF中CD80、CD86和OX－62表達(dá)水平3組間方差不齊，兩兩比較采用Dunnett法。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠一般情況及其肺組織病理學(xué)改變正常對(duì)照組：大鼠毛發(fā)有光澤，活潑好動(dòng)，呼吸平穩(wěn)，體質(zhì)量增加迅速，無(wú)死亡。鏡下見氣管表面纖毛排列整體，未見腺體及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；肺泡結(jié)構(gòu)正常連續(xù)，肺泡壁完整。COPD模型組：大鼠毛發(fā)逐漸失去光澤，神情倦怠，活動(dòng)減少，體質(zhì)量基本上無(wú)增加，反而下降，第7天開始出現(xiàn)噴嚏、倦怠及呼吸加深癥狀，且隨著造模時(shí)間增加，上述癥狀逐漸加重，稍動(dòng)即視其氣促。造模過(guò)程中COPD組大鼠死亡4只。鏡下可見大鼠支氣管黏膜上皮脫落，管壁及周圍大量單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔內(nèi)腺體增生，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁變薄或斷裂，肺泡腔擴(kuò)大，部分融合成肺大皰。見圖1A（插頁(yè)一）。CCL20抑制組：與正常對(duì)照組比較，逐漸出現(xiàn)咳、喘、氣促等癥狀，體質(zhì)量稍有下降；但與COPD組大鼠比較，咳、喘、氣促癥狀減輕，體質(zhì)量明顯高于COPD組。造模過(guò)程中CCL20抑制組大鼠死亡4只。與COPD組比較，CCL20抑制組大鼠肺組織炎癥和肺氣腫減輕。見圖1B（插頁(yè)一）。

2.2 3組大鼠外周血及BALF中CCL20含量3組大鼠外周血和BALF中CCL20含量總體比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝27.975和4.873，均P＜0.05）。與正常對(duì)照組比較，COPD組和CCL20抑制組大鼠外周血和BALF中CCL20含量均升高（均P＜0.05）；與COPD組比較，CCL20抑制組大鼠外周血CCL20含量無(wú)明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但CCL20抑制組大鼠BALF中CCL20含量降低（P＜0.05）。見表1。

表1 3組大鼠外周血及BALF中CCL20含量Tab.1 The contents of CCL20in peripheral blood and BALF of rats in three groups ［，ρB／（ng·L－1）］

表1 3組大鼠外周血及BALF中CCL20含量Tab.1 The contents of CCL20in peripheral blood and BALF of rats in three groups ［，ρB／（ng·L－1）］

＊P＜0.05compared with control group；△P＜0.05compared with COPD group.

Group n CCL20content Peripheral blood BALF Control 1622.25±6.05 11.70±8.80 COPD 12 69.35±14.37＊ 40.48±19.22＊CCL20inhibited 12 68.71±18.02＊ 32.04±10.52＊△

2.3 3組大鼠外周血中CD80、CD86、OX－62和MHC－Ⅱ的表達(dá)水平 3組大鼠外周血中CD80、CD86、OX－62和MHC－Ⅱ百分比總體比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝4.203、3.887、20.746和12.114，均 P＜0.05）。與正常對(duì)照組比較，COPD組大鼠外周血中CD80、CD86和OX－62百分比均升高（均P＜0.05），MHC－Ⅱ百分比降低（P＜0.05）；CCL20抑制組大鼠外周血CD80百分比升高（P＜0.05），MHC－Ⅱ百分比降低（P＜0.05），CD86和OX－62百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；與COPD組比較，CCL20抑制組大鼠外周血CD86和OX－62百分比均降低（均P＜0.05），CD80和MHC－Ⅱ百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表2。

表2 3組大鼠外周血中CD80、CD86、OX－62和MHC－Ⅱ的百分比Tab.2 The percentages of CD80，CD86，OX－62and MHC－Ⅱin peripheral blood of rats in three groups （，η／%）

表2 3組大鼠外周血中CD80、CD86、OX－62和MHC－Ⅱ的百分比Tab.2 The percentages of CD80，CD86，OX－62and MHC－Ⅱin peripheral blood of rats in three groups （，η／%）

＊P＜0.05compared with control group；△P＜0.05compared with COPD group.

Group n CD80 CD86 OX－62 MHC－ⅡControl 16 25.06±1.63 11.33±0.80 5.62±1.40 33.13±3.76 COPD 12 30.77±3.44＊ 14.09±2.60＊ 10.54±1.13＊ 21.73±5.75＊CCL20inhibited 12 29.39±4.82＊ 11.23±3.54△ 5.32±2.05△ 22.31±3.72＊

2.4 3組大鼠BALF中CD80、CD86、OX－62和MHC－Ⅱ的表達(dá)水平 3組大鼠BALF中CD80和CD86百分比總體比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝4.265和6.738，均P＜0.05），OX－62百分比比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝1.544和0.045，均P＞0.05）。與正常對(duì)照組比較，COPD組和CCL20抑制組大鼠BALF中CD80和CD86百分比升高（均P＜0.05）。與COPD組比較，CCL20抑制組大鼠BALF中CD80百分比降低（P＜0.05），CD86百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 3組大鼠BALF中CD80、CD86和OX－62的百分比Tab.3 The percentages of CD80，CD86，OX－62and MHC－Ⅱin BALF of rats in three groups（，η／%）

表3 3組大鼠BALF中CD80、CD86和OX－62的百分比Tab.3 The percentages of CD80，CD86，OX－62and MHC－Ⅱin BALF of rats in three groups（，η／%）

＊P＜0.05compared with control group；△P＜0.05compared with COPD group.

Group n CD80 CD86 OX－62 Control 16 0.36±0.26 0.74±0.09 0.62±0.68 COPD 12 1.39±0.69＊ 1.64±0.67＊ 0.57±0.46 CCL20inhibited 12 0.85±0.24＊△ 1.33±0.25＊0.48±0.09

3 討 論

COPD是一種可防和可治的疾病，與肺臟對(duì)吸入的有害顆?；驓怏w產(chǎn)生的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)。目前關(guān)于 COPD與 DCs、CCL20／CCR6關(guān)系的研究［3－4］較多。人體研究［5］發(fā)現(xiàn)：COPD 患者氣道內(nèi)DCs及CCL20的含量明顯增加，且與疾病的嚴(yán)重程度呈正比，2009年本課題組在對(duì)COPD患者的研究［6］中得到了一致的結(jié)果。動(dòng)物研究［7］發(fā)現(xiàn)：CCR6基因缺陷鼠BALF中DCs的數(shù)量減少，CCL20蛋白含量也明顯下降，肺組織炎癥和肺氣腫較COPD鼠減輕，提示CCL20／CCR6相互作用對(duì)于DCs的募集起重要作用。CCL20是CC家族的趨化因子，是DCs最強(qiáng)有力的趨化因子。當(dāng)吸煙等有害物質(zhì)侵襲肺臟時(shí)，CCL20在DCs遷移到局部淋巴結(jié)的過(guò)程中起到了重要的趨化作用。經(jīng)抑制CCL20活性能否減輕炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而延緩COPD進(jìn)展，對(duì)此本文作者進(jìn)行關(guān)于CCL20抗體抑制CCL20活性，從而影響DCs在COPD發(fā)病中作用的研究。

COPD動(dòng)物模型的建立方法眾多，目前被動(dòng)吸煙聯(lián)合氣道內(nèi)注入LPS法已經(jīng)成為最為常見的造模方法，多項(xiàng)研究結(jié)果證實(shí)這種COPD大鼠的細(xì)胞學(xué)、組織病理學(xué)及肺功能均符合人類COPD的特征，可用于人類COPD發(fā)生發(fā)展的研究。本研究組通過(guò)此方法亦建立符合人類COPD的病理改變的動(dòng)物模型［8］。在此模型建立成功的基礎(chǔ)上，本文作者進(jìn)一步研究應(yīng)用CCL20單克隆抗體的CCL20抑制型COPD動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)中病理結(jié)果顯示：與COPD組比較，CCL20抑制組大鼠肺組織炎癥和肺氣腫減輕，表明CCL20抗體對(duì)COPD的氣道炎癥及病理?yè)p害過(guò)程可能有一定的抑制作用［9］。造模過(guò)程中，在氣道內(nèi)注 LPS操作時(shí)COPD模型組及CCL20抑制組大鼠均有死亡，可能與該操作過(guò)程中LPS溶液緊急吸入呼吸道和肺泡內(nèi)引起的窒息有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示：COPD組大鼠外周血及BALF中CCL20含量及DCs百分比較正常組增多，與前期人體研究結(jié)果相符。與正常對(duì)照組比較，COPD組和CCL20抑制組大鼠外周血CCL20的含量明顯增加，這可能與實(shí)驗(yàn)中LPS的刺激有關(guān)［10］，但CCL20抑制組大鼠BALF中CCL20含量低于COPD組，提示CCL20可能參與了COPD的發(fā)病過(guò)程。

與正常對(duì)照組比較，COPD組大鼠外周血中CD80、CD86和OX－62百分比均升高，提示COPD發(fā)病過(guò)程中由造血組織到達(dá)外周血中的DCs含量增加，有利于DCs募集到COPD氣道組織，但MHC－Ⅱ降低，可能與測(cè)定時(shí)其不能被熒光抗體有效識(shí)別，或者COPD可能導(dǎo)致其過(guò)早凋亡有關(guān)，故在BALF中將不作為研究指標(biāo)；與COPD組比較，CCL20抑制組大鼠外周血CD86和OX－62百分比降低，提示應(yīng)用CCL20單克隆抗體可以減輕COPD外周血中DCs的增加，有助于減輕DCs在COPD氣道內(nèi)的募集。與正常對(duì)照組比較，COPD組大鼠BALF中CD80和CD86百分比升高，提示COPD氣道內(nèi)DCs增加，氣道損傷嚴(yán)重，進(jìn)而導(dǎo)致COPD的發(fā)生。與COPD組比較，CCL20抑制組大鼠CD80百分比降低，但仍較正常對(duì)照組增高，提示應(yīng)用CCL20單克隆抗體后，COPD氣道內(nèi)DCs的增加可以得到抑制。

CCL20單克隆抗體通過(guò)干擾CCL20的趨化作用，從而抑制CCL20／CCR6途徑的激活，目前在結(jié)腸炎、乙型肝炎、變應(yīng)性鼻炎、關(guān)節(jié)炎、呼吸道合胞病毒等疾病的研究［2，11－13］中較多，結(jié)果證實(shí)其拮抗作用較好。但本研究發(fā)現(xiàn)CCL20抗體并不能充分抑制氣道內(nèi)DCs的增加，且與COPD組比較，CCL20抑制組大鼠外周血中CD80及BALF中CD86并無(wú)顯著性變化，這可能與模型中CCL20抗體劑量、注入時(shí)間及方式尚需摸索調(diào)整，以增強(qiáng)其抑制作用；也可能由于單純采用CCL20抗體只能在一定程度上抑制CCL20的功能，并不能有效減少CCL20的產(chǎn)生有關(guān)。

總之，CCL20可影響DCs在COPD氣道內(nèi)的募集，CCL20單克隆抗體減輕了外周血和氣道中DCs的增長(zhǎng)，從病理結(jié)果來(lái)看，其對(duì)COPD的氣道炎癥及病理?yè)p害過(guò)程有一定的抑制或延緩作用。

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