陽(yáng) 琰，鄧華聰，龍 健，蘇艷新，瞿 華，胡振平

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，重慶 400016））

高甘油三酯（hypertriglyceridemia，HTG）所致的脂毒性近年來(lái)已引起人們的高度重視。HTG能抑制胰島素的信號(hào)傳遞，從而引起并加重胰島素抵抗（insulin resistance，IR），使胰島素的生物效應(yīng)降低，又能引起葡萄糖刺激的胰島素分泌障礙，并導(dǎo)致β細(xì)胞凋亡，使胰島素分泌減少［1］，并與心血管病密切相關(guān)。人脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞分泌的一種特異性蛋白質(zhì)，載脂蛋白A5（apolipoprotein A5，apoA5）是目前所知唯一能夠降低血漿甘油三酯（triglyceride，TG）的載脂蛋白，均與TG水平密切相關(guān)［2－4］。但是，脂聯(lián)素與apoA5和TG之間是否呈劑量依賴關(guān)系，目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。因此，本研究擬通過(guò)觀察比較不同濃度脂聯(lián)素對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)apoA5mRNA和蛋白表達(dá)水平及TG含量的影響，探討脂聯(lián)素與TG之間的劑量依賴關(guān)系，以及脂聯(lián)素降低TG的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑 HepG2細(xì)胞購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)院細(xì)胞庫(kù)。人脂聯(lián)素蛋白購(gòu)自美國(guó)R＆D公司。DMEM購(gòu)于Gibco－BRL公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季清公司。Trizol regent、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Taq酶均購(gòu)自Takara公司。PCR引物由上海基康生物技術(shù)有限公司合成。apoA5抗體（ab36974）購(gòu)自Santacruz公司。二抗和細(xì)胞蛋白抽提試劑盒均購(gòu)自凱基生物技術(shù)研究所。TG測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京中生北控公司。二甲亞砜（DMSO）購(gòu)自上海博耀生物科技有限公司。

1.2 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)與分組用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰酶消化，每2～3d更換1次培養(yǎng)基并傳代。用不同濃度脂聯(lián)素（0、12.5、25.0、50.0mg·L－1）作用 HepG2 細(xì)胞24h，取生長(zhǎng)良好的HepG2細(xì)胞（80%），胰酶消化后，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至2×105mL－1，接種于6孔培養(yǎng)板中傳代培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，顯微鏡下觀察細(xì)胞密度達(dá)5000個(gè)細(xì)胞／孔，PBS漂洗2次；改用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)，分為4組（每組取3個(gè)復(fù)孔，所測(cè)結(jié)果取3孔平均值）：對(duì)照組，無(wú)脂聯(lián)素；低劑量組，12.5mg·L－1脂聯(lián)素；中劑量組，25.0mg·L－1脂聯(lián)素；高劑量組，50.0mg·L－1脂聯(lián)素。

1.3 酶法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)TG含量 吸去6孔板中培養(yǎng)基，加入預(yù)冷PBS緩沖液2mL洗2次，每次輕柔振搖數(shù)次以盡量去除培養(yǎng)液。細(xì)胞洗滌后，加入適量PBS緩沖液，用細(xì)胞刮將貼壁上細(xì)胞刮下，轉(zhuǎn)至新的預(yù)冷的離心管中，1000r·min－1、4℃離心10min，棄去上清液，加入200μL異丙醇以抽提細(xì)胞中的脂質(zhì)。－70℃／37℃反復(fù)凍融數(shù)次，在顯微鏡下觀察，見(jiàn)細(xì)胞全部碎裂，9000r·min－1離心10min，將上清轉(zhuǎn)移到另一清潔1.5mL離心管中，加入1mol·L－1的 NaOH 20μL，溶解管底蛋白沉淀12h以上，BCA法測(cè)定蛋白含量。加入TG測(cè)定試劑，37℃孵育30min。讀取吸光度（A）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算TG含量，并用TG含量除以蛋白含量，計(jì)算出細(xì)胞內(nèi)TG含量（單位：mg·g－1）。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR法檢測(cè)apoA5 mRNA水平 提取細(xì)胞總RNA，以總RNA 1.5μg為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)模板，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄總的反應(yīng)體積為20μL。人apoa5引物正義：5′－CATCCAGCCTCCTGCGACTC－3′；反義：5′－TCCCTACTCCCTCACCCTTG－3′。GAPDH引物正義：5′－TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG－3′；反義：5′－TGCTGTCACCTTCACCGTTC－3′。反應(yīng)體系總體積為25μL，Sterile water 16.3μL，10×Taq buffer 2.5μL，apoa5 引物1（10μmol·L－1）0.75μL，apoa5引物2（10μmol·L－1）0.75μL，MgCl2（25mmol·L－1）1.5μL，4dNTP（2.5mmol·L－1）2μL，cDNA 1μL，Taq酶（5U）0.2μL。條件：95℃、5min，95℃、30s，退火溫度61℃、30s，72℃、延長(zhǎng)20s，循環(huán)37次，72℃延長(zhǎng)10min。以待測(cè)樣品目的基因的拷貝數(shù)平均值除以該樣品內(nèi)參基因的拷貝數(shù)平均值，得到目的基因的相對(duì)含量。樣品中模板的拷貝數(shù)，可由SDS軟件通過(guò)所得到的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算得到。

1.5 Western blotting法檢測(cè)apoA5蛋白水平收集經(jīng)上述處理后的細(xì)胞，取30μg蛋白質(zhì)加樣，經(jīng)12%PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，取抗apoA5一抗稀釋度為1∶2000，二抗稀釋度為1∶1000，堿性磷酸酶法顯色，曝光。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，apoA5mRNA水平和TG含量以表示，各組細(xì)胞內(nèi)apoA5mRNA和蛋白表達(dá)水平及TG含量為正態(tài)分布資料，應(yīng)用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)資料的方差分析及兩兩比較分析各組之間的差異。

2 結(jié) 果

2.1 各組HepG2細(xì)胞內(nèi)apoA5mRNA和蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，脂聯(lián)素各組HepG2細(xì)胞內(nèi)apoA5mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯增加（P＜0.05）；與低劑量脂聯(lián)素組比較，中、高劑量脂聯(lián)素組HepG2細(xì)胞中apoA5mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯增加（P＜0.05）；與中劑量脂聯(lián)素組比較，高劑量組HepG2細(xì)胞內(nèi)apoA5mRNA和蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但有增加趨勢(shì)。見(jiàn)表1和圖1。

2.2 各組HepG2細(xì)胞內(nèi)TG含量 與對(duì)照組比較，脂聯(lián)素各組HepG2細(xì)胞內(nèi)TG含量均明顯降低（P＜0.05）；與低劑量脂聯(lián)素組比較，中、高劑量脂聯(lián)素組HepG2細(xì)胞內(nèi)TG含量均明顯降低（P＜0.05）；但高劑量組與中劑量組TG含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但有降低趨勢(shì)。見(jiàn)表1。

表1 各組HepG2細(xì)胞中apoA5mRNA表達(dá)及TG含量比較Tab.1 Comparisons of apoA5mRNA expressions and TG contents in HepG2cells between various groups （）

表1 各組HepG2細(xì)胞中apoA5mRNA表達(dá)及TG含量比較Tab.1 Comparisons of apoA5mRNA expressions and TG contents in HepG2cells between various groups （）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vslow dose adiponectin group.

Group apoA5mRNA TG（mg·g－1）Control 1.10±0.18 423±57 Adiponectin Low dose 1.51±0.32＊ 339±42＊Middle dose 2.58±0.41＊△ 235±31＊△High dose 3.15±0.67＊△ 228±29＊△

圖1 各組HepG2細(xì)胞中apoA5蛋白表達(dá)比較Fig.1 Comparisons of apoA5protein expressions in HepG2 cells between various groups

3 討 論

研究［5］認(rèn)為：HTG與2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系，其機(jī)制可能為：① HTG血癥引起IR，影響胰島β細(xì)胞分泌功能；②HTG血癥時(shí)游離脂肪酸（FFA）含量增高，F(xiàn)FA在β細(xì)胞內(nèi)氧化代謝增強(qiáng)，抑制葡萄糖的氧化代謝，從而引起葡萄糖刺激胰島素分泌障礙，從而導(dǎo)致T2DM發(fā)生。2012年，歐洲心臟病學(xué)會(huì)（ESC）和歐洲動(dòng)脈粥樣硬化學(xué)會(huì)（EAS）聯(lián)合發(fā)布的血脂異常管理指南明確指出：富含HTG的脂蛋白是心血管疾病的高危因素［6］。因此，HTG在脂毒性危害中占據(jù)非常重要的地位，對(duì)TG代謝研究勢(shì)必成為學(xué)術(shù)研究熱點(diǎn)。

脂聯(lián)素是由脂肪細(xì)胞分泌的一種激素蛋白，已有資料顯示脂聯(lián)素在血脂代謝中發(fā)揮重要作用。人脂聯(lián)素由244個(gè)氨基酸組成，ELISA法測(cè)定正常人血漿脂聯(lián)素濃度為5～30mg·L－1［7］。目前，流行病學(xué)資料和臨床研究［8］顯示：脂聯(lián)素與IR、TG呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與高密度脂蛋白－膽固醇（HDL－C）呈正相關(guān)關(guān)系。最近研究［9－10］表明：脂聯(lián)素主要通過(guò)改變關(guān)鍵酶（脂蛋白酯酶、肝酯酶）的濃度及活性調(diào)節(jié)富含TG的脂蛋白的代謝。有研究［11］發(fā)現(xiàn)：血清脂聯(lián)素水平與TG代謝密切相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)T2DM并發(fā)HTG患者血清脂聯(lián)素水平較單純T2DM患者明顯降低。apoA5特異表達(dá)于肝臟，肝臟apoA5表達(dá)降低可能是發(fā)生HTG的關(guān)鍵因子之一［12－13］。脂聯(lián)素和apoA5均與 TG 代謝密切相關(guān)［14］，但是關(guān)于脂聯(lián)素在肝臟調(diào)節(jié)TG是否與apoA5表達(dá)有關(guān)，目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。本研究結(jié)果顯示：脂聯(lián)素能升高HepG2細(xì)胞內(nèi)apoA5mRNA和蛋白表達(dá)及降低TG含量，并呈劑量依賴關(guān)系，當(dāng)脂聯(lián)素濃度達(dá)到25mg·L－1，其升高apoA5表達(dá)及降低TG作用達(dá)到最大，與50mg·L－1脂聯(lián)素比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明脂聯(lián)素濃度處于生理濃度高限時(shí)可以明顯降低TG水平，這一作用可能與其能明顯升高apoA5mRNA和蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

綜上所述，脂聯(lián)素能降低HepG2細(xì)胞內(nèi)TG含量，兩者之間具有劑量依賴關(guān)系，即隨著脂聯(lián)素濃度逐漸增加，apoA5mRNA和蛋白表達(dá)水平逐漸增加，TG水平逐漸降低。本課題組前期人體實(shí)驗(yàn)［15］結(jié)果顯示：血漿脂聯(lián)素水平與apoA5呈正相關(guān)關(guān)系，與TG呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，故本文作者認(rèn)為脂聯(lián)素降低肝臟TG可能是通過(guò)增加apoA5表達(dá)而實(shí)現(xiàn)，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究探索。

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