李海燕，曹勵(lì)民，賀紅艷，黃鳳霞

（西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系，陜西 西安 710021）

原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，其復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移影響了肝癌患者的預(yù)后。抑制肝癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移可延長肝癌患者的生存期，改善其生活質(zhì)量。全反式維甲酸（all－trans retinoic acid，ATRA）為維生素A的氧化代謝產(chǎn)物，是常用的誘導(dǎo)分化劑。近年研究［1－3］發(fā)現(xiàn)：ATRA 及其衍生物除廣泛應(yīng)用于白血病的治療外，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)還證實(shí)其可促進(jìn)多種實(shí)體瘤細(xì)胞的分化，明顯抑制乳腺癌、肝癌和胃癌細(xì)胞等的侵襲和轉(zhuǎn)移。ATRA誘導(dǎo)分化對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移可能具有一定的預(yù)防和治療作用，但具體的分子機(jī)制尚不十分清楚。因此本文作者探討ATRA對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC－7721增殖、遷移和侵襲能力的影響及其分子機(jī)制，旨在為ATRA用于肝癌的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑 人肝癌細(xì)胞株SMMC－7721引自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；ATRA購自Sigma公司，用二甲基亞礬（DMSO）配制濃度為10mmol·L－1的存儲(chǔ)液，分裝后于－20℃避光保存。RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco公司），小牛血清（杭州四季青生物工程公司），Transwell小室（3428型，美國 Coming公司），Matrigel（5g·L－1），美國BD公司），Total RNA Kit（美國 Omega 公司），F(xiàn)luorophore Sybr Green（Netherlands公司）。BCA蛋白定量檢測試劑盒（美國Pierce公司），ECL發(fā)光檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），胰蛋白酶（Amresco公司），基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP－9）和α－tublin一抗（美國ABCAM公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株SMMC－7721培養(yǎng)于含有10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在5%CO2濃度、飽和濕度及37℃孵育箱中培養(yǎng)，3～4d傳代1次，選取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組將處于對(duì)數(shù)生長期的SMMC－7721細(xì)胞分為空白對(duì)照組和10、20和40μmol·L－1ATRA組。

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 收集處于對(duì)數(shù)期生長的腫瘤細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液密度，接種于96孔板，每孔200μL，5000個(gè)細(xì)胞／孔，孵育24h使細(xì)胞貼壁。細(xì)胞貼壁后棄上清，更換新鮮的培養(yǎng)液，180μL／孔，并加入20μL的各濃度藥液，含ATRA分別為10、20和40μmol·L－1，空白對(duì)照僅加入20μL培養(yǎng)基，每組6個(gè)復(fù)孔，置搖床上低速振蕩混勻，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h后加入20μL／孔 MTS／PMS溶液，MTS的終質(zhì)量濃度為333μg·L－1，PMS的終濃度為25μmol·L－1，繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后置搖床上低速振蕩10min，測量各孔在490nm處的吸光度（A）值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以增殖率表示藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響。增殖率 ＝ （各組所得到的A值／空白對(duì)照組A值）×100%。

1.5 劃痕愈合法測定細(xì)胞遷移能力 將2×106個(gè)SMMC－7721細(xì)胞接種在6孔板，培養(yǎng)至90%融合狀態(tài)，無血清培養(yǎng)基洗3次，換無血清培養(yǎng)基饑餓24h；用10μL移液器的槍頭沿培養(yǎng)板底部做“1”字劃痕，劃痕時(shí)要以直尺定位。無血清培養(yǎng)基洗3次，換新鮮無血清培養(yǎng)基，加入ATRA調(diào)節(jié)濃度為10、20和40μmol·L－1。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，倒置顯微鏡下在劃痕同一位置觀察并拍照，使用Image J軟件測量并統(tǒng)計(jì)劃痕區(qū)寬度。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組均設(shè)3個(gè)平行樣本。

1.6 Transwell小室實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞侵襲能力 將Transwell放入24孔板內(nèi)，Matrigel與無血清培養(yǎng)基1∶9配制，Transwell上層鋪50μL稀釋的Matrigel，37℃過夜至 Matrigel膠凝固，種植細(xì)胞，每孔細(xì)胞數(shù)量為1×105個(gè)，無血清培養(yǎng)基300μL，加入ATRA，調(diào)節(jié)藥物濃度為10、20和40μmol·L－1，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。24h后分別取出小室，以PBS清洗3次，用棉簽小心刮除濾膜上面的細(xì)胞，膜下面細(xì)胞用甲醛固定，并以1%結(jié)晶紫染色15min，PBS洗3次。倒置顯微鏡下高倍鏡觀察并拍照，Image J軟件計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)值，結(jié)果以細(xì)胞數(shù)表示。

1.7 Real－time PCR 以10、20和40μmol·L－1ATRA處理細(xì)胞，在24h以Total RNA Kit提取細(xì)胞總RNA，按試劑盒要求，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。MMP－9基因引物及內(nèi)參GAPDH基因引物設(shè)計(jì)及反應(yīng)參數(shù)參考相關(guān)文獻(xiàn)［4－5］，引物經(jīng)上海生物工程有限公司鑒定其合理性后生成。MMP－9，F(xiàn)：5′－TTCCCCTTCACTTTCCTGGGTA－3′，R：5′－CGCCACGAGGAACAAACTGTAT－3′；GAPDH，F(xiàn)：5′－GCACCGTCAAGGCTGAGAAC－3′，R：5′－TGGTGAAGACGCCAGTGGA－3′。

使用儀器CFD3120MiniOpticon Detector（BIO－RAD，California，USA）進(jìn) 行 Real－time PCR，按照儀器使用說明書及其軟件進(jìn)行相應(yīng)的設(shè)置。每個(gè)循環(huán)末自動(dòng)記錄熒光強(qiáng)度，結(jié)果應(yīng)用GraphPad.Prism.v5.0.軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，相對(duì)表達(dá)量采用2－ΔΔCT方法計(jì)算，－ ΔΔCT ＝－（ΔCT0q－ΔCT0cb）［6］。

1.8 Western blotting 以10、20和40μmol·L－1ATRA處理細(xì)胞，在24h收集細(xì)胞，PBS洗3次，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解提細(xì)胞總蛋白。蛋白質(zhì)定量變性后上樣，SDS－PAGE電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，半干標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)膜90min。將轉(zhuǎn)有蛋白條帶的膜常規(guī)封閉、洗膜后分別與特異性一抗4℃孵育過夜，TBST洗3次，每次5min，二抗室溫孵育1h，TBST洗3次，每次5min，化學(xué)發(fā)光劑檢測蛋白質(zhì)印跡，薄層掃描儀測定印跡區(qū)帶的A值。觀察各條帶深淺變化并加以分析，α－tublin作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果在凝膠成像儀上照相并使用Bio－Rad公司Quantity One分析軟件測量條帶灰度值，目的條帶與α－tublin條帶灰度值比值即為該目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，增殖率以百分比表示，劃痕距離和穿膜細(xì)胞數(shù)以表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 ATRA作用下人肝癌SMMC－7721細(xì)胞的增殖能力 空白對(duì)照組與10、20和40μmol·L－1ATRA組SMMC－7721細(xì)胞的增殖率分別為94%、82%、60%和34%，與空白對(duì)照組比較，20和40μmol·L－1ATRA組SMMC－7721細(xì)胞的增殖率明顯降低（P＜0.01）。

2.2 ATRA作用下人肝癌SMMC－7721細(xì)胞的遷移能力 空白對(duì)照組SMMC－7721細(xì)胞在0h劃痕距離為（186.00±0.56）μm，在24h劃痕距離為（35.00±0.41）μm，24h細(xì)胞劃痕距離較0h明顯減少（P＜0.05），表明 SMMC－7721細(xì)胞具有較強(qiáng)的遷移能力。與空白對(duì)照組比較，10、20和40μmol·L－1ATRA組細(xì)胞在0h劃痕距離較一致；而處理24h后，10、20和40μmol·L－1ATRA組的劃痕距離分別為（37.00±0.53）、（98.00±0.62）和（107.00±0.81）μm，與空白對(duì)照組比較，10μmol·L－1ATRA組劃痕距離無明顯變化，而20和40μmol·L－1ATRA組劃痕距離明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1（封二）。

2.3 ATRA作用下人肝癌SMMC－7721細(xì)胞的侵襲能力 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：10、20和40μmol·L－1ATRA組SMMC－7721細(xì)胞處理24h后，穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（45.30±0.52）、（32.80±0.21）和（21.50±0.64）個(gè)，較空白對(duì)照組［（63.60±0.45）個(gè)］明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2（插頁一）。

2.4 ATRA作用下SMMC－7721細(xì)胞中MMP－9 mRNA和蛋白的表達(dá) Real－time PCR結(jié)果：空白對(duì)照組與10、20和40μmol·L－1ATRA組SMMC－7721細(xì)胞處理24h后，MMP－9mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為 0.18、0.12、0.07和0.03，20和40μmol·L－1ATRA組MMP－9mRNA表達(dá)水平明顯低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；Western blotting結(jié)果：空白對(duì)照組與10、20和40μmol·L－1ATRA組SMMC－7721細(xì)胞處理24h后，MMP－9蛋白表達(dá)相對(duì)值分別為0.98、0.84、0.63和0.45，20和40μmol·L－1ATRA組蛋白表達(dá)相對(duì)值較空白對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖3。

圖3 ATRA作用下SMMC－7721細(xì)胞中 MMP－9蛋白表達(dá)Fig.3 The MMP－9protein expression in SMMC－77211 cells after treated with ATRA

3 討 論

惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤患者死亡的主要原因。尋找有效的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物一直是藥物研發(fā)的熱點(diǎn)［7－9］。阻斷腫瘤細(xì)胞黏附、侵襲和遷移過程的各環(huán)節(jié)均有可能抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。

ATRA作為誘導(dǎo)分化劑在急性早幼粒細(xì)胞白血病中的應(yīng)用取得了令人鼓舞的成效，這促使人們考慮其應(yīng)用于其他實(shí)體瘤的治療是否依然有效。近年來，很多研究者已從細(xì)胞學(xué)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及臨床試驗(yàn)的角度對(duì)胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、甲狀腺癌等惡性腫瘤應(yīng)用ATRA進(jìn)行誘導(dǎo)、分化的治療。初步研究的結(jié)果顯示：ATRA對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)分化、抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡等作用，同時(shí)在抑制實(shí)體腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中也逐漸顯示其作用［10－12］。

本研究結(jié)果顯示：ATRA可以呈劑量依賴性抑制SMMC－7721細(xì)胞的增殖，20.0μmol·L－1以上摩爾濃度可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，這與劉子文等［13］的研究結(jié)果相一致；表明其可呈劑量依賴性抑制SMMC－7721細(xì)胞的遷移能力。

劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、Transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)是目前常用的體外研究腫瘤細(xì)胞侵襲行為的經(jīng)典方法。本研究中劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：空白對(duì)照組細(xì)胞具有很強(qiáng)的遷移能力，劃痕后24h，劃痕處大部分愈合。而在ATRA組，作用于SMMC－7721細(xì)胞后，其遷移能力卻非常弱，對(duì)比劃痕0h的圖片結(jié)果，經(jīng)過24h的培養(yǎng)，劃痕處未見愈合。Transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：隨著ATRA作用于SMMC－7721細(xì)胞劑量的增加、時(shí)間的延長，SMMC－7721細(xì)胞的穿膜數(shù)明顯低于空白對(duì)照組。提示ATRA可抑制SMMC－7721細(xì)胞的侵襲能力，這與汪思應(yīng)等［14］和李冰等［15］的研究結(jié)果一致。

MMP－9是相對(duì)分子質(zhì)量最大的基質(zhì)金屬酶，主要降解和破壞Ⅳ型膠原。Ⅳ型膠原是阻礙腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵屏障基底膜的主要成分，因此，MMP－9被認(rèn)為是腫瘤局部侵襲和轉(zhuǎn)移的重要分子。MMP－9在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的重要作用，還包括調(diào)節(jié)細(xì)胞間的黏附和促進(jìn)腫瘤血管的生成。本研究結(jié)果顯示：ATRA無論從mRNA水平還是蛋白水平均呈劑量依賴性下調(diào) MMP－9的表達(dá)。

本研究初步證明了ATRA能夠抑制人肝癌SMMC－7721細(xì)胞的增殖和侵襲能力，其對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的抑制可能與下調(diào)MMP－9有關(guān)，進(jìn)一步的分子機(jī)制尚需深入研究。

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