肖 靜 張 英 于瑋婷 王 為 馬小軍*

1(中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所生物醫(yī)用材料工程組，大連 116023)

2(南通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院職業(yè)衛(wèi)生與環(huán)境毒理學(xué)教研室，南通 226019)

引言

自20世紀(jì)80年代初，Lim提出并制備具有良好生物相容性的海藻酸鈉微膠囊以來［1］，該模型已在細(xì)胞移植治療、規(guī)?；囵B(yǎng)、藥物篩選控釋等方面廣為應(yīng)用［2－3］。同時研究者也在不斷對微囊環(huán)境進(jìn)行探索，以解決目前仍困擾微囊應(yīng)用的諸如囊內(nèi)細(xì)胞延遲期長、代謝率降低及中心壞死等問題。對囊內(nèi)細(xì)胞生長代謝規(guī)律、微囊微環(huán)境和細(xì)胞作用方式的充分認(rèn)識是解決以上問題的關(guān)鍵。微囊微環(huán)境是微囊制備培養(yǎng)過程中各種因素共同作用的結(jié)果，其中包括多種“脅迫”應(yīng)激因素，如熱“脅迫”、氧化“脅迫”、滲透壓“脅迫”等［4］，這些應(yīng)激因素可通過誘導(dǎo)基因表達(dá)和信號傳遞，影響細(xì)胞生長代謝。目前發(fā)現(xiàn)，微囊化細(xì)胞脂代謝通量增加，并能間接影響細(xì)胞生長和生物合成［5－6］，究其原因可能與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，但具體作用機(jī)制尚不清楚。

鑒于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵作用，以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在脂類代謝中的重要地位，本研究擬以HepG2為模型，以平面細(xì)胞為參照，考察微囊化對細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)影響，并以拮抗劑進(jìn)行干預(yù)，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在微囊化細(xì)胞脂代謝異常中的作用和對細(xì)胞合成功能的影響，以便為優(yōu)化微囊化細(xì)胞培養(yǎng)，研究微囊環(huán)境與細(xì)胞作用規(guī)律提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞株HepG2購自ATCC，海藻酸鈉、聚賴氨酸、胰蛋白酶、Hoechst 33258、四苯基乙酸購自Sigma公司，白蛋白檢測試劑盒購自Bethyl公司，甘油三酯微量檢測試劑盒、總膽固醇微量檢測試劑盒購自BioVision公司，Trizol裂解液、RT－PCR 試劑盒購自TaKaRa公司，MEM培養(yǎng)液購自Hyclone公司，胎牛血清購自北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。實驗儀器包括YD－4型微膠囊靜電液滴發(fā)生器(中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所)、CX31數(shù)碼圖像采集系統(tǒng)(Olympus公司，日本)、PCR儀(Eppendorf公司，德國)、微量紫外定量分析儀(NanoDrop公司，日本)、全自動酶標(biāo)儀(Labsystems公司，芬蘭)、LS55熒光分光光度計(PerkinElmer公司，英國)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

平面細(xì)胞:HepG2細(xì)胞用MEM培養(yǎng)液(15%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素、1 mM丙酮酸鈉)5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。微囊化細(xì)胞:細(xì)胞生長至對數(shù)期，用0.25%胰酶消化離心收集，懸浮于1.5%(w/v)海藻酸鈉溶液，細(xì)胞密度2×109/L。利用微囊靜電液滴發(fā)生器噴入0.1 M CaCl2溶液形成海藻酸鈣膠珠，電壓400 V，頻率0.05 Hz、脈寬2 ms、然后用 0.05%(w/v)多聚賴氨酸包裹，再與0.15%(w/v)海藻酸鈉溶液反應(yīng)，最后用55 mM檸檬酸鈉溶液液化，微囊直徑為(300±50)μm。獲得微囊化HepG2細(xì)胞37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

用相差顯微鏡觀察微囊化細(xì)胞生長狀態(tài)。

1.2.3 MTT法測定細(xì)胞活性

平面細(xì)胞:HepG2細(xì)胞懸液200 μL接種于96孔板中，最終細(xì)胞量5×104/孔，另設(shè)兩平行樣共3個檢測孔。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后在待測孔加入20 μL MTT 溶液(5 mg/mL、PBS 溶液配制，4 ℃避光保存)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后鏡下觀察有不溶性甲臜顆粒生成，棄上清加入200 μL DMSO溶解結(jié)晶。微囊化細(xì)胞:微囊化HepG2細(xì)胞懸液2 mL接種于24孔板中，最終細(xì)胞量5×104/孔，另設(shè)兩平行樣共3個檢測孔。培養(yǎng)24 h后在待測孔加入100 μL MTT溶液，37℃ 孵育24 h后篩網(wǎng)過濾收集微囊，溶于1 mL DMSO溶液。檢測時取平面或微囊化細(xì)胞紫色DMSO溶解上清100 μL，置酶標(biāo)儀測定每孔OD值，測定波長570 nm，參考波長620 nm。

1.2.4 DNA分析法測定細(xì)胞數(shù)量

平面細(xì)胞胰酶消化后用含proteinase K裂解液50℃孵育12 h，釋放DNA;微囊化細(xì)胞用PBS清洗破囊，加入含proteinase K裂解液釋放DNA。加入熒光染料Hoechst 33258，測定熒光光度值變化(Ex=355 nm，Em=460 nm)，根據(jù)細(xì)胞數(shù)和DNA熒光光度標(biāo)準(zhǔn)曲線確定細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 ELISA檢測白蛋白分泌水平

白蛋白檢測依試劑說明書，每檢測孔加100 μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，用酶標(biāo)儀測定450 nm的吸光度值。

1.2.6 脂代謝水平檢測

微囊化細(xì)胞在不同培養(yǎng)時間破囊收集細(xì)胞，貼壁細(xì)胞在對數(shù)生長期消化收集細(xì)胞。乙烷－丙酮法［7］抽提總膽固醇和甘油三酯，試劑盒測定其含量。

1.2.7 4－苯基丁酸干預(yù)評價

配置含不同濃度4－苯基丁酸(4－phenylbutyric acid，4－PBA)(0.1、0.5、1 mmol)培養(yǎng)液。于培養(yǎng)不同時間留取上清，檢測白蛋白含量和脂代謝水平，MTT法測定細(xì)胞活性，DNA分析測定細(xì)胞數(shù)，同時測定基因表達(dá)。

1.2.7 Real Time－PCR檢測基因表達(dá)

提取細(xì)胞總RNA，兩步法反轉(zhuǎn)錄和實時PCR，反轉(zhuǎn)錄條件37℃ 15 min、85℃ 15 s;實時PCR條件:預(yù)變性95℃ 30 s，PCR反應(yīng)95℃ 5 s、60℃ 20 s，擴(kuò)增40個循環(huán)，引物設(shè)計如表1。

表1 基因引物設(shè)計Tab.1 Prime sequences of different gene detected by PCR

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 微囊化對HepG2細(xì)胞生長代謝的影響

為了解微囊化對細(xì)胞影響，以平面細(xì)胞為對照，對ERS相關(guān)基因表達(dá)和胞內(nèi)脂代謝產(chǎn)物含量進(jìn)行考察。如圖1(a)所示，微囊細(xì)胞中ERS基因葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78(glucose regulating protein 78，GRP78)和 C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)表達(dá)均顯著增高，分別為平面細(xì)胞3.6倍(P=0.016)和 1.9倍(P=0.010)(P＜0.05)。同時胞內(nèi)總膽固醇(total cholesterol，CHO)和甘油三酯(triglyceride，TG)含量也出現(xiàn)了增高，分別為 29.53±2.21 μg/106細(xì)胞和 83.17±6.49 μg/106細(xì)胞，為平面細(xì)胞1.7倍(P=0.016)和3.2倍(P=0.014)(P＜0.05)(見圖1(b))。

圖1 微囊化對HepG2細(xì)胞的影響。(a)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因表達(dá)影響;(b)對脂代謝影響Fig.1 The influence of microencapsulation on HepG2 cells.(a)The influence on ERS gene expression;(b)The influence on lipid metabolism.

2.2 4-PBA干預(yù)對細(xì)胞活性的影響

為驗證ERS和微囊化細(xì)胞脂代謝調(diào)節(jié)的關(guān)系，采用ERS拮抗劑4－PBA對其進(jìn)行干預(yù)，若干預(yù)后ERS途徑被抑制的同時，細(xì)胞脂代謝也隨之改變，則說明兩者之間存在一定關(guān)聯(lián)。首先在不同培養(yǎng)方式下，對4－PBA有效作用劑量進(jìn)行考察。

如圖2所示，在平面細(xì)胞和微囊化細(xì)胞培養(yǎng)過程中分別添加不同濃度的4－PBA。對平面細(xì)胞而言，4－PBA各濃度組細(xì)胞活性均未見明顯改變(見圖2(a))。而在微囊化細(xì)胞中，4－PBA在0.5 mM時即使細(xì)胞活性有所改善但差異并不顯著，當(dāng)濃度提高到1 mM時微囊化細(xì)胞活性顯著提高(P=0.003)(見圖2(b))。同時對微囊化細(xì)胞干預(yù)前后形態(tài)進(jìn)行了觀察，如圖3所示未添加4－PBA微囊化細(xì)胞在制備初期生長相對緩慢，以數(shù)個分散細(xì)胞團(tuán)方式聚團(tuán)匯集。隨培養(yǎng)時間延長，形成大小不同的細(xì)胞聚集體向囊中心遷移，直到培養(yǎng)第15 d細(xì)胞團(tuán)大小才達(dá)到100 μm左右((a)～(d))。而在加入1 mM 4－PBA后細(xì)胞成團(tuán)速度有所提升，在培養(yǎng)第15 d時，干預(yù)組細(xì)胞團(tuán)均大于100 μm，個別囊內(nèi)細(xì)胞團(tuán)已超過300 μm((d)～(f))。

圖2 四苯基丁酸對HepG2細(xì)胞活性影響。(a)平面細(xì)胞;(b)微囊化細(xì)胞Fig.2 The effect of 4-PBA on HepG2 cell viability.(a)Monolayer cells;(b)Microencapsualted cells.

2.3 4-PBA干預(yù)對微囊細(xì)胞ERS基因表達(dá)和脂代謝影響

鑒于4－PBA對微囊化細(xì)胞的有效濃度為1 mM，因此比較此濃度下，微囊化細(xì)胞ERS表達(dá)、脂代謝水平的變化。結(jié)果如圖4(a)中可知，4－PBA處理后微囊化細(xì)胞ERS基因GRP78和CHOP表達(dá)明顯下降(P=0.031，P=0.024)，較對照組分別降低了50%和30%。同時胞內(nèi)總膽固醇和甘油三酯含量較對照降低30%和15%(P=0.008，P=0.033)。

2.4 4-PBA干預(yù)對微囊細(xì)胞生物合成功能影響

實驗同時考察了 4－PBA處理前后微囊化HepG2細(xì)胞白蛋白水平的變化，結(jié)果如圖5所示，4－PBA干預(yù)組明顯改善細(xì)胞合成分泌白蛋白能力，且趨勢隨培養(yǎng)時間延長而更為顯著，自培養(yǎng)第10 d起，干預(yù)組白蛋白水平較對照組顯著提高(P=0.008)。

圖3 微囊化HepG2細(xì)胞形態(tài)(標(biāo)尺為100 μm)。(a)對照組培養(yǎng)第2 d;(b)對照組培養(yǎng)第7 d;(c)對照組培養(yǎng)第15 d;(d)1 mM 4-PBA處理組培養(yǎng)第2 d;(e)1 mM 4-PBA處理組培養(yǎng)第7 d;(f)1 mM 4-PBA處理組培養(yǎng)第15 dFig.3 The growth of microencapsulated HepG2 cells:(a)Control group day 2;(b)Control group day 6;(c)Control group day 13;(d)1 mM 4-PBA-treated group day 2;(e)1 mM 4-PBA-treated group day 7;(f)1 mM 4-PBA-treated group day 15(bars=100 μm)

圖4 四苯基丁酸對微囊化細(xì)胞的影響。(a)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因表達(dá)的影響;(b)對脂代謝的影響Fig.4 The influence of 4-PBA on microencapsulated cells.(a)The influence on gene expression;(b)The influence on lipid metabolism

圖5 四苯基丁酸對微囊化細(xì)胞白蛋白水平影響Fig.5 The influence of 4-PBA on alb content in microencapsulated HepG2 cells

3 討論

微囊環(huán)境是受限于生物半透膜所形成的復(fù)雜場所，由于半透膜所具有的特殊性質(zhì)，使囊內(nèi)細(xì)胞在形態(tài)、生化特性、基因表達(dá)等多方面有異于平面細(xì)胞，因此在生物醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。但微囊細(xì)胞長期培養(yǎng)中存在的代謝速率降低、生物合成功能減退等仍是該技術(shù)應(yīng)用中需要面對的問題，解決這些難題的關(guān)鍵在于對微囊微環(huán)境的了解，尤其是對囊內(nèi)細(xì)胞與微囊環(huán)境作用規(guī)律的充分認(rèn)識。有研究發(fā)現(xiàn)微囊化細(xì)胞脂代謝水平增加，并能間接對細(xì)胞線粒體功能和生物合成產(chǎn)生抑制［6］，本課題組前期結(jié)果也顯示脂代謝亢進(jìn)和微囊化細(xì)胞培養(yǎng)后期的功能減退存在關(guān)聯(lián)［8］，但其中機(jī)制尤其引起脂代謝上調(diào)的原因目前尚不明確。

近年研究發(fā)現(xiàn)ERS在脂代謝失調(diào)及相關(guān)病理改變中發(fā)揮重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是胞內(nèi)重要亞細(xì)胞器，與蛋白、氨基多糖、脂類及鈣信號代謝息息相關(guān)。環(huán)境誘因如氧化應(yīng)激、ATP耗竭、缺氧、鈣超載及營養(yǎng)物質(zhì)失衡等都有誘發(fā) ERS 的可能［9－10］。ERS可通過級聯(lián)反應(yīng)對固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(Sterol regulatory element binding proteins，SREBPs)等轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而對下游包括膽固醇合成酶系基因、脂肪酸合成酶系基因及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)生影響，加劇胞內(nèi)甘油三酯和膽固醇異常積聚，其過程伴有GRP78和CHOP等ERS標(biāo)志蛋白的表達(dá)改變［11］。晏春根等發(fā)現(xiàn)在同型半胱氨酸介導(dǎo)的ERS中，出現(xiàn)內(nèi)源性膽固醇調(diào)節(jié)通路失調(diào)，并使肝細(xì)胞合成攝取TG和CHO顯著增加［12］。此外在動物模型中同樣發(fā)現(xiàn)GRP78表達(dá)增加和脂代謝異常有關(guān)，通過基因敲除方式干擾ERS途徑后，大鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯脂肪變性，研究者認(rèn)為該模型中ERS是造成肝細(xì)胞脂代謝亢進(jìn)的基礎(chǔ)［13］。此外Chikka等也發(fā)現(xiàn)ERS標(biāo)志蛋白CHOP表達(dá)增加與脂代謝亢進(jìn)關(guān)系密切，因CHOP能直接作用于基因啟動子區(qū)，影響包括Cebpa、Ppara和Srebf1在內(nèi)的多個脂代謝調(diào)節(jié)基因，對代謝過程產(chǎn)生干擾［14］。鑒于以上研究基礎(chǔ)，Shin等采用酪氨酸蛋白激酶抑制劑來考察ERS拮抗劑對脂代謝調(diào)節(jié)的影響，實驗通過抑制 GRP78等蛋白表達(dá)，使脂代謝相關(guān)基因FAS、SCD1、GPAT和ACC等表達(dá)和轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，因此認(rèn)定ERS發(fā)生和脂代謝調(diào)節(jié)關(guān)聯(lián)密切，且ERS拮抗對脂代謝失調(diào)有明顯改善作用［15］，類似結(jié)果在Peng和Liang等人研究中也有報道［16－17］。

本次實驗發(fā)現(xiàn)微囊化細(xì)胞GRP78和CHOP表達(dá)顯著增加，說明微囊內(nèi)存在ERS。而其誘因首先可能與微囊制備中的高壓脈沖電場有關(guān)。高壓脈沖靜電可使水分子分解，形成超氧負(fù)離子自由基引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜脂質(zhì)超氧化，造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白結(jié)構(gòu)的破壞，并通過觸發(fā)線粒體膜孔開放引起瀑布樣級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)入惡性循環(huán)使應(yīng)激長期持續(xù)［18］。電場也可以通過破壞生物膜電荷平衡使之相變，打破內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)誘發(fā)應(yīng)激［19］。其次，微囊制備所需鈣化過程也可能是造成ERS出現(xiàn)的原因。Charleta等實驗表明CaCl2對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器有顯著影響，Ca2+會導(dǎo)致細(xì)胞器在胞內(nèi)聚集使相應(yīng)分子濃度增加，干擾細(xì)胞穩(wěn)態(tài)引起應(yīng)激發(fā)生［20］，而GRP78作為Ca2+結(jié)合蛋白，在此狀態(tài)下表達(dá)量可增高10～25倍，以維護(hù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定［21］。同時Ca2+的存在也可通過影響線粒體結(jié)構(gòu)和功能，間接引起ERS［22］。但除微囊制備對細(xì)胞的影響外，以三維方式生長的細(xì)胞本身也有誘發(fā)ERS的可能［23］。Yuan等研究發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)方式形成的三維細(xì)胞團(tuán)隨培養(yǎng)時間延長，會出現(xiàn)GRP78等ERS基因表達(dá)的顯著增高［24］，這可能與細(xì)胞生長過程中營養(yǎng)梯度變化及中心氧濃度降低后低糖、缺氧及酸中毒的微環(huán)境出現(xiàn)，從而導(dǎo)致錯誤折疊和未折疊蛋白增多有關(guān)［9－10，23］。因此微囊制備過程并非造成ERS發(fā)生的唯一原因。實驗中除ERS相關(guān)基因表達(dá)改變外，微囊細(xì)胞胞內(nèi)CHO和TG也顯著增加，為驗證這一脂代謝增強(qiáng)反應(yīng)是否與ERS有關(guān)，采用ERS拮抗劑4－PBA對培養(yǎng)過程進(jìn)行干預(yù)，比較干預(yù)前后各指標(biāo)的變化。4－PBA是一種低分子量化學(xué)伴侶，能降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)突變或錯誤定位蛋白導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷增加，是一種有效的ERS拮抗劑［25］。實驗中未發(fā)現(xiàn)4－PBA對平面細(xì)胞的影響，當(dāng)其作用于微囊化細(xì)胞時，在0.5 mM即使細(xì)胞活性出現(xiàn)了增加，且在1 mM時改善效果更為顯著，這一結(jié)果也從反面驗證微囊內(nèi)存在ERS。與此同時，4－PBA能明顯減低GRP78和CHOP的表達(dá)，這可能由于4－PBA作為分子伴侶可促進(jìn)蛋白正確折疊，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)從而抑制GRP78、CHOP與膜受體的解離，因此使其表達(dá)降低。在作用于微囊化細(xì)胞ERS的同時，發(fā)現(xiàn)4－PBA干預(yù)組脂代謝水平即胞內(nèi)CHO和TG含量較對照組顯著降低，這可能由于ERS被4－PBA所拮抗后，對SREBP－1c等因子的調(diào)控作用減弱有關(guān)。但也注意到，干預(yù)組脂代謝水平仍遠(yuǎn)高于平面細(xì)胞，說明微囊內(nèi)還存在其他干擾代謝平衡的因素。同時，4－PBA在0.1 mM時使個別天數(shù)下微囊細(xì)胞活性出現(xiàn)了降低，這可能由于4－PBA雖然具有拮抗ERS的作用，但同時會對細(xì)胞周期調(diào)控產(chǎn)生影響，造成G1/G0期阻滯影響細(xì)胞增殖，直到隨著濃度增高4－PBA對ERS的正面拮抗作用抵消了對細(xì)胞周期調(diào)控的負(fù)面影響，才使細(xì)胞活性出現(xiàn)顯著增加［26］。另外，在添加4－PBA后微囊化HepG2細(xì)胞白蛋白水平出現(xiàn)了顯著升高，這可能由于4－PBA干預(yù)緩解了脂代謝亢進(jìn)對線粒體的抑制，使蛋白合成過程能量供給得以恢復(fù)，同時4－PBA起到了恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常功能的作用，使其加工處理蛋白的效率得到恢復(fù)，因此使白蛋白含量有所增加。

4 結(jié)論

總結(jié)以上實驗結(jié)果認(rèn)為，微囊環(huán)境可誘使細(xì)胞出現(xiàn)ERS，并通過ERS相關(guān)通路，對細(xì)胞脂代謝產(chǎn)生影響，造成微囊化細(xì)胞的脂代謝增強(qiáng);微囊化對細(xì)胞的以上影響能被ERS拮抗劑所緩解，使相關(guān)基因表達(dá)降低、脂代謝通量下調(diào)，同時起到改善囊內(nèi)細(xì)胞生物合成的作用。以上實驗結(jié)果將有助于了解微囊微環(huán)境對細(xì)胞生長代謝影響的具體機(jī)制，為微囊化技術(shù)改進(jìn)和實際應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

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