李維杰 周新麗* 劉寶林 戴建軍 呂福扣 張德福 徐 利

1(上海理工大學生物熱科學研究所，上海 200093)

2(上海農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所上海農業(yè)遺傳育種重點實驗室動物遺傳工程研究室，上海 201106)

引言

生殖細胞的低溫保存是低溫生物醫(yī)學研究的重要內容，可以使得優(yōu)秀或瀕危的動物品種突破時間和空間的限制，得以繁衍生息;可為不孕不育患者提供幫助。卵母細胞作為哺乳動物的雌性配子由于體積大，對溫度敏感，1987年才真正得以保存，但效果并不理想［1］。目前保存卵母細胞效果最好的方式為Cryotop玻璃化保存卵母細胞，該方法利用體積最小的原理，將體積小于0.1μL的低溫保護液連同卵母細胞滴加到Cryotop載體上，迅速插入液氮，實現(xiàn)細胞快速降溫，由于使用的低溫保護劑溶液體積小，降溫過程中直接插入液氮，降溫速度高，玻璃化程度高，對細胞損傷較小，因此存活率較高，但是仍然不十分理想。

為了突破制約當前低溫保存的技術瓶頸，近年來出現(xiàn)了將納米技術與低溫工程學相結合的低溫保存策略——納米低溫保存。它是將具有生物相容性的納米顆粒加入低溫保護劑中，對細胞或組織實施離體保存。納米顆粒是直徑為1～100 nm的粒子，由于自身的小體積效應，納米顆粒在強化傳熱、促進成核、低溫保護劑性能改善等方面起到重要作用。郝保同等在低溫保護劑中加入納米微粒［2］，發(fā)現(xiàn)納米顆粒可以改變低溫保護劑的傳熱系數(shù)和黏度，同時也可以改變冰晶的形成狀況，降低低溫保護劑的反玻璃化溫度，有利于細胞的低溫保存。徐海峰等認為添加納米顆粒可以改變低溫保護劑的結晶焓［3］。李方方數(shù)值模擬了納米冷凍過程溫度場和應力場分布［4］，發(fā)現(xiàn)納米顆粒能強化散熱，增強力學性能，減少組織的溫度梯度，提高應力承受能力。通常情況下低溫保護劑中加入納米微粒，可以有效提升保護劑的熱導率和黏度［5］。Hao等采用DSC測量了含有不同濃度納米顆粒的聚乙烯吡咯烷酮低溫保護劑的比熱容、玻璃化溫度和反玻璃化溫度［6］，結果表明其均隨納米顆粒的濃度增大而降低，溶液的導溫系數(shù)也能升高，玻璃化轉變溫度卻降低4～7℃。常溫下，向乙二醇溶液中加入納米微粒能夠提高溶液的導熱系數(shù)［7］。Han發(fā)現(xiàn)添加0.2%(w/w)鉆石納米微粒到乙二醇溶液［8］，冷凍速率提高一倍，而導熱系數(shù)增加不超過5%，比熱容和潛熱量稍有降低，但成核溫度卻顯著升高。改變溶液的結晶性質可以通過添加納米粒子來完成［9］。

學術界一直研究納米顆粒有利于細胞低溫保存的機理，很少應用于實踐，本研究首先比較了粒徑20 nm的羥基磷灰石(HA)、二氧化硅(SiO2)、三氧化二鋁(Al2O3)、二氧化鈦(TiO2)納米顆粒在不同濃度下對卵母細胞的毒性，其次在安全濃度0.1%下，將各種納米粒子添加到低溫保護劑中，使用Cryotop法冷凍豬GV卵母細胞，比較顆粒種類、粒徑、濃度等因素對細胞復溫后存活率的影響，然后對復溫后的細胞培養(yǎng)42 h，比較發(fā)育到MⅡ期的發(fā)育率。

1 材料與方法

1.1 實驗設備與材料

1.1.1 主要儀器和設備

BC－J160S CO2培養(yǎng)箱:上海博訊實業(yè)有限公司，中國;TS100倒置熒光顯微鏡:Nikon，日本;YDS－35－20 液氮罐:東亞壓力容器，中國;SW－CJ－1CU 超凈工作臺:松泰凈化科技有限公司，中國;Cryotop載板:KITAZATO，日本。

1.1.2 主要試劑

實驗中所用的試劑除特別說明外，均來自美國Sigma公司。TCM199培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS):Gibco公司，美國。納米顆粒(包括20 nm、40 nm 和60 nm HA納米顆粒，20 nm SiO2納米顆粒，20 nm Al2O3納米顆粒，20 nm TiO2納米顆粒):南京歐瑞納米科技有限公司，中國。

1.1.3 玻璃化冷凍/解凍液

基礎液:TCM199+20%FBS;預平衡液:基礎液+8%Me2SO+8% 乙二醇(ethylene glycol，EG);玻璃化冷凍液(vitrification solution，VS):基礎液 +15%Me2SO+15%EG+0.5 mol/L蔗糖;解凍液:分別以基礎液+0.5 mol/L蔗糖，基礎液+0.25 mol/L蔗糖構成不同蔗糖濃度的解凍液。

1.2 實驗方法與步驟

1.2.1 豬卵母細胞的采集及GV期卵母細胞的獲得

卵巢采集于上海市長寧區(qū)復興屠宰場。在豬屠宰后立即取卵巢組織，將采集的豬卵巢放入含1000 μg/mL雙抗生理鹽水中(35～37℃)，2 h內運回實驗室。用95%酒精對卵巢表面進行噴灑消毒，再用滅菌的生理鹽水洗滌2～3次。選擇直徑為2～8 mm的卵泡，使用帶有大號針頭、20 mL的一次性注射器(注射器中裝有少量的TCMl99)將卵母細胞復合體連同卵泡液一起吸出。將抽出的卵泡液置于50 mm的培養(yǎng)皿中，在39℃恒溫臺上靜放10 min，移除上清液。取有3層以上卵丘細胞包裹且胞質均勻的卵丘卵母細胞復合體，洗滌3次進行實驗。

1.2.2 納米顆粒毒性判定

分別添加0.05%、0.1%、0.5%，1%的粒徑為20 nm 的 HA、SiO2、Al2O3、TiO2，4 種納米顆粒到TCM199，將含有納米粒子的保護劑分別滴加到多孔板中，石蠟油液封，放在培養(yǎng)箱中預熱2 h，將GV期的卵母細胞加入含有納米顆粒的TCM199中，每孔加入卵50枚左右。培養(yǎng)42 h。成熟培養(yǎng)后的卵母細胞凈透明質酸酶消化以去除卵丘細胞，用TCM199洗3～5遍備用。卵母細胞用熒光素雙醋酸酯(fluorescein diacetate，F(xiàn)DA)染色 3 min，再用基礎液洗3～4遍，在倒置顯微鏡下觀察是否著色。胚胎有熒光反應的為活卵，沒有熒光反應的為死卵。

1.2.3 卵母細胞玻璃化冷凍及解凍程序

對照實驗組所用冷凍保護劑為玻璃化冷凍液，實驗組冷凍保護劑為玻璃化冷凍液中添加一定比例的納米顆粒，超聲震蕩，使其充分分散。

冷凍:將10枚卵母細胞為一組，從基礎液中移至預平衡液中平衡3 min，然后移至50 μL的玻璃化冷凍液中平衡30 s。用吸管將細胞滴加載到Cryotop載板上，再用毛細管移去一部分多余的冷凍保護劑，之后將帶有細胞的Cryotop快速插入液氮中，實施冷凍。

解凍:細胞冷凍72 h后，進行細胞解凍。解凍采用三步法解凍。迅速將Cryotop裝置連同細胞一起從液氮中取出，先直接浸入37℃的基礎液+0.5 mol/L蔗糖液解凍，浸沒時間大約3 min。將卵母細胞快速移入37℃的基礎液+0.25 mol/L蔗糖液解凍，浸沒時間3 min。將卵母細胞快速移入37℃的TCM199基礎液。以此3個步驟，逐級脫除冷凍保護劑，實現(xiàn)卵母細胞的完全解凍。

1.2.4 卵母細胞體解凍后存活率和發(fā)育率判斷

觀察解凍的細胞，對于卵丘覆蓋良好、形態(tài)完整的細胞可以認為是存活的，反之，則認為細胞死亡。存活細胞數(shù)與細胞總數(shù)之比為存活率。

經洗滌后的卵丘卵母細胞復合體放入在培養(yǎng)箱內已平衡4 h以上的成熟液(TCM199+10%FBS+10% 豬卵泡液 +激素)中，成熟培養(yǎng)42 h。成熟培養(yǎng)后的卵母細胞凈透明質酸酶消化以去除卵丘細胞，用TCM199洗3～5遍備用。卵母細胞用FDA染色3 min，再用基礎液洗3～4遍，在倒置顯微鏡下觀察是否著色。有熒光反應的為發(fā)育后的卵，沒有熒光反應的為死卵。發(fā)育到MII的存活細胞數(shù)與細胞總數(shù)之比為發(fā)育率。

1.2.5 數(shù)據統(tǒng)計

實驗結果采用SPSS Statistics 17.0數(shù)據處理軟件進行顯著性分析，實驗組之間采用配對樣本t檢驗，P＜0.05為顯著性差異標準。

2 結果

2.1 不同納米顆粒毒性

顆粒直徑為 20 nm 的 HA、SiO2、Al2O3、TiO2納米顆粒按照0.05%、0.1%、0.5%、1%的濃度(w/w)添加到細胞培養(yǎng)液中，經過42 h的培養(yǎng)，納米顆粒均發(fā)生了很嚴重的沉降和團聚現(xiàn)象，吸附在細胞表面，使用毛細管口吸器可以將吸附在表面的納米顆粒打散，之后統(tǒng)計細胞發(fā)育率如表1。在較低濃度(＜0.1%)納米顆粒中培養(yǎng)的細胞均未死亡，都順利培養(yǎng)到MⅡ期。而當濃度為0.5%時，HA依舊對細胞無毒性，而其它納米顆粒(SiO2、Al2O3、TiO2)會影響細胞的發(fā)育，當納米顆粒的濃度達到1%時，所有的納米顆粒均影響細胞發(fā)育。

表1 不同納米顆粒對豬GV期卵母細胞的毒性Tab.1 The toxicity of different nanoparticles on the porcine GV-stage oocytes

2.2 不同的納米顆粒對細胞冷凍效果的影響

將濃度為0.1%、粒徑為20 nm的 HA、SiO2、Al2O3、TiO2的納米顆粒添加到玻璃化冷凍液中，使用Cryotop法進行冷凍，發(fā)現(xiàn)添加納米顆粒之后低溫保存效果差異較大，結果如表2。解凍后直接觀察發(fā)現(xiàn)細胞存活率較高，卵母細胞出現(xiàn)破裂、變形等情況的概率不大，大部分卵形態(tài)完整，值得注意的是添加了Al2O3納米顆粒的卵的形態(tài)完好性較低為92%，而未添加和添加其他納米的組都在98%以上，但是各組差異不顯著。對冷凍后的卵培養(yǎng)42 h觀察發(fā)現(xiàn)，加入HA納米顆粒的組比不加入納米顆粒的組發(fā)育率有了顯著的增加，高達22%，而對照組僅為14%，添加SiO2盡管也有提高(16%)但不顯著，而Al2O3和TiO2居然有反作用，存活率分別為2%和6%，遠低于對照。

表2 不同種類納米顆粒對豬GV期卵母細胞的冷凍效果Tab.2 The effect of different nanoparticles on cryopreservation of porcine GV-stage oocytes

2.3 不同粒徑的納米顆粒對冷凍效果的影響

將濃度為0.1%粒徑為20、40、60 nm的HA納米顆粒添加到冷凍保護液中，使用Cryotop法冷凍，結果如表3。添加了納米顆粒的實驗組冷凍后卵的形態(tài)完整性較未添加組有所提高，但不顯著。當培養(yǎng)42 h后，卵由GV期發(fā)育為MⅡ期的比例有所增加，比對照的14.2%，有顯著增加，其中40、60 nm顆粒的效果較好，發(fā)育率均為28.7%，而20 nm實驗組發(fā)育率相對較低為26.7%，而各實驗組之間沒有顯著差異。

表3 納米顆粒粒徑對對豬GV期卵母細胞的冷凍效果Tab.3 The effect of particle size on cryopreservation of porcine GV-stage oocytes

2.4 羥基磷灰石濃度對卵母細胞低溫保存效果的影響

將60 nm的 HA以 0.01%、0.02%、0.05%、0.1%、0.5%濃度添加到玻璃化保存液中，進行冷凍、復溫、培養(yǎng)，實驗重復3次，每組50個左右，結果如表4。添加了60 nmHA顆粒之后，復溫后卵細胞形態(tài)完整性較未添加有所提高，但不顯著。當培養(yǎng)42 h后，差異性十分明顯，分別添加 0.01%、0.02%、0.05%和0.1%的組發(fā)育率顯著提高，但組別之間區(qū)別不顯著，其中添加0.05%的組發(fā)育率最高，達到30.4%比對照組的一倍還多。而添加0.5%的組也有提高，但與對照差異不顯著。

表4 HA濃度對對豬GV期卵母細胞的冷凍效果Tab.4 The effect of HA concentration on cryopreservation of porcine GV-stage oocytes

3 討論

添加納米顆粒到培養(yǎng)液中會影響細胞的發(fā)育，這是由于顆粒本身體積較小，具有表面吸附等小體積效應，可以吸附培養(yǎng)基中的化學成分，改變pH值和營養(yǎng)組成，造成細胞死亡，同時，由于顆粒較小，在培養(yǎng)過程中可能進入細胞內部，和細胞器以及染色體相結合，影響細胞器的發(fā)育［10－11］。由于HA自身穩(wěn)定性等原因的影響，毒性相對較低，在0.5%時未對細胞培養(yǎng)造成影響［12］。當納米粒子濃度達到1%，所有的細胞都受到了不同程度的影響，只是HA的毒性相對較小，對細胞的影響不大，而其它三種尤其Al2O3的毒性較大，成活率太低。可以認為，納米顆粒低濃度時對細胞毒性小，高濃度對細胞毒性大。當納米粒子濃度高于0.5%時也會發(fā)生很嚴重的團聚現(xiàn)象，影響培養(yǎng)、冷凍等操作過程，而低濃度時團聚現(xiàn)象不明顯，便于操作。此外考慮到納米顆粒在分子水平對細胞染色體的損傷不能通過FDA染色觀察到，因此盡量在低濃度區(qū)間進行后續(xù)實驗，同時，為了保證納米粒子在冷凍過程中的效果，濃度亦不能太低。

納米顆粒的種類影響著冷凍和復溫過程的結晶和重結晶過程。冷凍過程是一個復雜的物理過程，而加入納米顆?？梢允贵w系的玻璃化和重結晶過程更加復雜。一方面加入納米顆?？梢詮娀?，增加導熱系數(shù)，減少反玻璃化結晶［13］，有利于細胞保存，另一方面可以促進溶液成核，不利于玻璃化。在成核與反玻璃化的博弈中，當玻璃化占優(yōu)勢時，就能提升細胞的存活率，反之可能降低存活率。由于納米顆粒的物理性質與種類相關，其對細胞玻璃化保存效果的影響也有所不同。

研究HA納米顆粒的粒徑對細胞發(fā)育率的影響時發(fā)現(xiàn)，粒徑對發(fā)育率影響不大，這是由于商品化的納米顆粒并不是都保證為一個尺寸，其尺寸范圍為一個很廣的區(qū)間，標示60 nm的顆粒，其成分中含有20 nm和40 nm的成分，只是60 nm占主要，同理其它粒徑的納米顆粒的粒徑分布也很廣，因此樣本的差異性并不很大，實驗結果差異性不大也在所難免。此外，納米顆粒對冰晶的結晶性質的影響是一個復雜的過程［2］，是多方因素共同作用的結果，納米顆粒的粒徑對于結晶性質只是一個很小的影響因素。

羥基磷灰石的加入提高了GV期卵母細胞的冷凍存活率和發(fā)育率。當HA濃度達到0.05%時，反玻璃化效果最好，保存效果亦最好。原因可能是低溫保護劑中添加適當濃度的納米顆粒，可以改善溶液結晶性，減少冰晶數(shù)量，有利于細胞低溫保存效果，也可能是低溫保護劑中添加納米顆粒減少了復溫過程的重結晶。在一定的濃度范圍內，納米顆粒對細胞低溫保存有效果，超過該范圍反而對細胞有毒性。不同的顆粒的范圍可能不同，由于實驗量和精力的限制，只找到了HA納米顆粒的較有益濃度。由于其它的納米顆粒和HA的理化性質不同，在其它的濃度范圍內，可能會對細胞冷凍保存也有積極作用。

4 結論

不同種類的納米顆粒對細胞的毒性不同，一般低濃度時毒性低，高濃度時毒性高，會殺死細胞。在低溫保護劑中添加適宜濃度的HA納米顆粒，可以減少復溫過程中的重結晶現(xiàn)象，促進細胞的冷凍存活率和發(fā)育率，保存效果與濃度相關，而與納米顆粒的粒徑關系不大。

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