姚李四 邵麗筠 王 剛 劉 陽(yáng) 劉勇先 浦 昀 燕青麗張曉龍 張 吉 徐寶梁 王寶麟** 趙彤言

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100123；3.吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局，長(zhǎng)春 130062；4. 長(zhǎng)白出入境檢驗(yàn)檢疫局，吉林長(zhǎng)白 134400)

漢坦病毒是分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒，屬于布尼亞病毒科，其基因組由大(L)、中(M)和小(S)3個(gè)基因片段組成，分別編碼依賴(lài)RNA的RNA聚合酶、包膜糖蛋白Gn、Gc以及核蛋白。目前已發(fā)現(xiàn)至少30種不同型別的漢坦病毒，除一種外，其余的皆由鼠攜帶，傳播給人引起肺出血熱綜合征和腎出血熱綜合征，漢坦病毒的基因型別與宿主動(dòng)物之間大致存在一一對(duì)應(yīng)的共進(jìn)化關(guān)系(Plyusnin, 2002)。絕大多數(shù)腎出血熱綜合征病例發(fā)生在中國(guó)，主要是由黑線(xiàn)姬鼠攜帶漢灘病毒引起的重型出血熱和由褐家鼠攜帶漢城病毒引起的輕型出血熱。近幾十年來(lái)，由于綜合性防控措施的開(kāi)展，中國(guó)出血熱的病例和死亡率顯著下降，但東北地區(qū)出血熱的流行情況依然十分嚴(yán)重(Zhangetal., 2010)。

前期的研究顯示，東北地區(qū)漢坦病毒具有復(fù)雜的病原譜，至少存在4種型別的漢坦病毒，分別是puumala病毒(Liuetal., 2003; Zhangetal., 2007)、漢灘病毒(姚來(lái)順etal., 2009)、Amur樣病毒(Zhangetal., 2007)和漢城病毒(Zhang, 2009)。長(zhǎng)白縣屬于吉林省東部，位于長(zhǎng)白山主峰南麓，從1986年報(bào)道有出血熱病例以來(lái)，每年皆有病例報(bào)道，前期的研究顯示該縣存在漢坦病毒(劉紅秋等，2001)。該縣屬于山林地貌，大林姬鼠是當(dāng)?shù)氐膬?yōu)勢(shì)鼠種之一，當(dāng)?shù)厥欠翊嬖贏(yíng)mur樣病毒，此前尚未有研究，從2009年9月開(kāi)始，中朝跨境醫(yī)學(xué)媒介聯(lián)合監(jiān)測(cè)項(xiàng)目在中方的長(zhǎng)白縣和朝方的兩江道地區(qū)開(kāi)展，2011年，從800 m以上次生林生境中采集的大林姬鼠樣本中，檢測(cè)到Amur樣病毒核酸的存在，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2011年6、9月在長(zhǎng)白縣(經(jīng)度：41.27；緯度：128.14)，以油炸花生為誘餌用鼠籠捕鼠，每個(gè)地點(diǎn)每天布放鼠籠和鼠夾各100個(gè)，連續(xù)捕鼠3天，捕獲地點(diǎn)高度從850～1 085 m。每天傍晚布放鼠籠鼠夾，次日清晨收回，用乙醚麻醉捕獲的鼠后分揀寄生蟲(chóng)，隨后將其在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)解剖，取鼠肺、置于細(xì)胞凍存管內(nèi)，保存于液氮中，用干冰運(yùn)送回中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院保存于液氮中。

1.2 鼠肺的研磨

將鼠肺標(biāo)本從液氮中取出，置于冰上，在2級(jí)生物安全柜內(nèi)將重約25 mg 的鼠肺，置于2 mL離心管內(nèi)(管內(nèi)提前加入2個(gè)3 mm 不銹鋼珠)， 加入1 mL RPM 1640 培養(yǎng)液，用組織研磨器(Tissuelyser，Qiagen，德國(guó))研磨1 min，使組織成勻漿。將勻漿液4℃，1 000 g 離心1 min，上清轉(zhuǎn)至1.5 mL 離心管，用于核酸提取。

1.3 鼠肺總RNA 的提取及cDNA的制備

從鼠肺研磨上清中提取總RNA，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen，德國(guó))，按說(shuō)明書(shū)操作。取上述總RNA 5 μL放入200 μL的Eppendorf管中，加入2 μL P14引物(10 pmol/μL)，94℃變性3 min后迅速放入冰浴中退火雜交，然后依次加入2 μL 4×dNTPs(10 mmol/L)、0.5 μL RNasin、1 μL AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、4 μL AMV逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液，以DEPC高壓滅菌水補(bǔ)足20 μL。將以上混合體系混合，42℃作用60 min，72℃10 min滅活。

1.4 PCR及電泳

1.4.1引物: Amur病毒3個(gè)片段擴(kuò)增及鼠種鑒定的引物如表1。

表1 擴(kuò)增所用的引物名稱(chēng)及序列Tab.1 Primer name and sequence in this paper

1.4.2PCR反應(yīng): 取5 μL上述合成的cDNA為模板，依次加入10 μL 10×Buffer、4 μL dNTP、3 μL MgCl2(25 mmol/L)、各組上游和下游引物各1 μL、0.5 μL Taq DNA聚合酶，以高壓滅菌水補(bǔ)足50 μL的反應(yīng)體系，稍加離心后，放入PCR擴(kuò)增儀。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；然后進(jìn)入循環(huán)94℃，1 min, 52℃，1 min, 72℃，2 min，共35個(gè)循環(huán); 最后72℃，延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。克隆后送往北京華大基因公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.5 序列分析和進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

同源性序列分析采用Lasergene8.0軟件中的Megalign (Clewleyetal., 1997)程序，M片段編碼閱讀框(3 409個(gè)核苷酸)序列用來(lái)進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，運(yùn)用Mega5.1(Tamuraetal., 2011)軟件中鄰位法(Neighbor-Joining method, NJ method)程序，分析采用T92+G+I模型，其中G=0.85，I=0.40，categories=5，bootstraps=1000。

2 結(jié)果

2.1 采樣結(jié)果和鼠肺樣本檢測(cè)結(jié)果

兩次共采集大林姬鼠21只，從鼠肺樣本中檢測(cè)到Amur病毒特異性L(fǎng)片段序列2份，兩份樣本分別來(lái)自850 m和1 085 m兩個(gè)采樣點(diǎn)，兩個(gè)擴(kuò)增序列有一個(gè)堿基的差異，隨后對(duì)其中一個(gè)樣本的M和S片段的基因組進(jìn)行了擴(kuò)增測(cè)定。

2.2 擴(kuò)增結(jié)果

L片段擴(kuò)增大小為358 bp，M片段擴(kuò)增片段分別為782、918、743、765和467 bp，S片段擴(kuò)增大小約為1.8 kb。用1.5%瓊脂糖電泳結(jié)果如圖1所示。測(cè)定后的序列提交NCBI進(jìn)行登陸，L、M、S片段登錄號(hào)分別為JX119008、JX119009和JX119010。

圖1 Amur病毒L(左)、M(中)和S(右)PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 The result of PCR amplified of Amur virus L segment(left),segment(middle) and S segment(right)M：DL2000；A19, A99：A19, A99株L片段擴(kuò)增結(jié)果；M1～M5：M1～M5各片段擴(kuò)增結(jié)果；AS:S片段全長(zhǎng)擴(kuò)增結(jié)果.M:DL2000; A19,A99: L fragment of A19 and A99 strain; M1～M5：M1 to M5 fragment; AS: S fragment.

2.3 同源性比較和進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

根據(jù)和NCBI上公布的序列比對(duì)，結(jié)果顯示L片段和Amur病毒俄羅斯株AP209的同源性為88%，和韓國(guó)Soochong病毒SC-1株的同源性為86.7%(表2)。S片段和NA33株最接近，序列同源性為97%，和AP209的同源性為91%，和Soochong病毒SC-1、SC-3株的同源性分別為91.9%、87.8%(表3)。與漢坦病毒原型株76-118以及吉林漢坦病毒CJAp93株的同源性皆小于85%。

表2 L片段部分序列同源性比較Tab.2 Pair distance of partial sequence of L segment

注：三角上部分為序列相似度(百分?jǐn)?shù))，三角下部分為序列變異度(百分?jǐn)?shù))。表3同。

Note:Percent identity was showed in upper triangle, divergence was showed in lower triangle.The same with Tab.3.

表3 S片段序列同源性比較Tab.3 Pair distance completed sequence of S segment

圖2 基于鄰位法構(gòu)建的M片段進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of M segment based on Neighbor-Joining method

用M片段編碼閱讀框構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，M片段和H5株最為接近，序列同源性超過(guò)95%；和AP209的同源性為93%，和Soochong病毒SC-1、SC-3株的同源性分別為87.2%、86.4%?；谛蛄刑卣?，俄羅斯遠(yuǎn)東Amur病毒和我國(guó)報(bào)道的Amur病毒親緣關(guān)系較近，為同一亞型(圖2)。

3 討論

Yashina等(2000)測(cè)定了遠(yuǎn)東地區(qū)收集的110份出血熱病人的M基因的256個(gè)堿基核酸，發(fā)現(xiàn)存在3個(gè)不同的進(jìn)化群，并將其中一個(gè)命名為Amur病毒，與76-118漢坦病毒原型株的序列存在約15%到19%左右的變異。該作者又于次年報(bào)道從大林姬鼠中檢測(cè)到該病毒樣核酸，與從病人檢測(cè)到的核酸僅存3.1%到6.6%的核酸差異，并指出Yan等于1999年提交的漢坦病毒H8205株的序列和Amur樣病毒極其類(lèi)似，證實(shí)中國(guó)也存在A(yíng)mur病毒(Yashinaetal., 2000)。接著Lokugamage等(2002)對(duì)該類(lèi)似病毒進(jìn)行了M和S片段全序列測(cè)定，并發(fā)現(xiàn)M片段G2區(qū)的兩個(gè)氨基酸的改變可區(qū)分Amur樣病毒和其他漢坦病毒；并認(rèn)為，由于大林姬鼠在東亞地區(qū)廣泛存在，Amur樣病毒及其引起的病例在東亞也應(yīng)該是廣泛分布(Lokugamageetal., 2002)。隨后，有研究在大林姬鼠中首次分離到Soochong病毒，該病毒和Amur病毒可能由同一祖先進(jìn)化分支而來(lái)(Baeketal., 2006)。我國(guó)學(xué)者進(jìn)一步指出，兩種病毒應(yīng)為同一進(jìn)化分支病毒(Jiangetal., 2007)。

實(shí)際上，在我國(guó)Amur樣病毒也分布廣泛，從人血清中測(cè)定的Amur樣病毒有H820株、H5株， Liu株(黑龍江)、B78株(山東)等，另外，我國(guó)疫苗株A16已被證實(shí)是漢灘病毒和Amur樣病毒的重組病毒(Maetal., 2012)，這也提示我國(guó)中部地區(qū)也存在A(yíng)mur樣病毒。2007年又在吉林大林姬鼠中檢測(cè)到該病毒的存在(Zhangetal.,2007)。

長(zhǎng)白縣屬于鴨綠江源頭區(qū)域，森林覆蓋面積占80%以上，海拔高度大于700 m，大林姬鼠是當(dāng)?shù)氐膬?yōu)勢(shì)鼠種之一。本次研究在該區(qū)域區(qū)發(fā)現(xiàn)Amur樣病毒的存在，提示該地區(qū)的部分出血熱病例可能也由此病毒引起。其遺傳距離和H5株的值最小(0.25)，和JilinAP06的遺傳距離值稍大(0.47)，進(jìn)化圖顯示我國(guó)和俄羅斯的Amur樣病毒具有聚集性，這對(duì)于研究Amur樣病毒的進(jìn)化傳播具有意義。