賈修歧， 楊新宇， 李金旭， 金志民

(牡丹江師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 黑龍江 牡丹江 157011)

大林姬鼠與黑線姬鼠同屬于嚙齒目，鼠科，姬鼠屬，分類地位較近，廣泛分布于我國各地農(nóng)林區(qū)。大林姬鼠(Apodemuspeninsulae)主要以林木作物的種子、果實(shí)為食，因此對森林樹木的生長、繁殖造成極大的危害。黑線姬鼠(Apodemusagrarius)，不僅是主要害鼠之一，也是某些傳染疾病的主要宿主和傳染媒介，被列為我國衛(wèi)生防疫和植物保護(hù)的重點(diǎn)監(jiān)控對象[1]。

血清蛋白成分及其含量變化與機(jī)體健康、營養(yǎng)和疾病等有密切關(guān)系，動物血清蛋白圖譜具有種的特異性，對于建立種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)和遺傳育種具有重要意義[2]，其次蛋白質(zhì)是生物進(jìn)行生命活動的重要表現(xiàn)形式，同時其表達(dá)又與基因的調(diào)控密切相關(guān)，組織蛋白電泳圖譜所表現(xiàn)出條帶的數(shù)目、寬窄以及顏色的深淺和遷移率的大小均可從不同角度客觀反映該譜帶所對應(yīng)的等位基因遺傳本質(zhì)和活性的強(qiáng)弱[3]。

目前，關(guān)于大林姬鼠和黑線姬鼠的研究已有一些報道[4-8]，但對其血清蛋白和組織蛋白電泳比較分析尚未見報道。為此，采用PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)和SDS-PAGE(十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)的方法對大林姬鼠和黑線姬鼠的血清蛋白和組織蛋白進(jìn)行比較分析，并建立大林姬鼠和黑線姬鼠血清蛋白和組織蛋白圖譜，為大林姬鼠和黑線姬鼠的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動物 大林姬鼠、黑線姬鼠于2018年10月用鼠籠捕自黑龍江省牡丹江市三道關(guān)林區(qū)健康成年個體，雌雄個體各4支。

1.1.2 血清蛋白及組織蛋白樣品的制備

1) 血清的制備。從大林姬鼠、黑線姬鼠心臟采血，室內(nèi)靜置20 min后于4 000 r/min，4℃離心20 min，上清液為血清。

2) 組織蛋白的制備。分別取大林姬鼠、黑線姬鼠的腦臟、心臟、肺臟、肝臟、腎臟、肌肉于離心管中，按照1∶30的比例加入5%的十二烷基硫酸鈉(SDS)，用高速分散均質(zhì)機(jī)均質(zhì)，85℃保溫1 h后離心(8 000 r/min，4℃，20 min)，吸取上清液貯存于4℃冰箱中待測。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 DYY-Ⅲ2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、HWS28型電熱恒溫水浴鍋(北京市六一儀器廠生產(chǎn))、高速冷凍離心機(jī)(BECRMANTMCOULTERTM64R Centrifuge)、微量移液槍(Eppendorf)、凝膠成像系統(tǒng)(美國Alpha公司，AlphaImager Mini)。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)藥品 Tris、HCl、TEMED、過硫酸銨、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸、溴酚藍(lán)、蔗糖、巰基乙醇、SDS、甲醇、瓊脂糖、考馬斯亮藍(lán)R-250、丙三醇、冰乙酸等均為天津市永大化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的分析純或生化試劑，次高分子量蛋白質(zhì)Marker由Solarbio生產(chǎn)。

1.2 電泳

分別采用PAGE和SDS-PAGE垂直板電泳的方法[9-10]，對大林姬鼠和黑線姬鼠的血清蛋白和組織蛋白進(jìn)行分離、分析。為避免電泳處譜帶的偶然誤差，分別在與每個樣本相鄰的點(diǎn)樣孔進(jìn)行重復(fù)點(diǎn)樣。血清蛋白和組織蛋白染色方法分別參照文獻(xiàn)[11]和[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大林姬鼠、黑線姬鼠的血清蛋白電泳

由圖1、表1可見，大林姬鼠、黑線姬鼠血清蛋白共分出39條譜帶，其中雄、雌大林姬鼠各分出14條譜帶，雄、雌黑線姬鼠分別分離出19條、12條譜帶。按電泳遷移率的不同將電泳圖譜劃分為4個區(qū)域：Ⅰ區(qū)為清蛋白區(qū)，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ區(qū)為球蛋白區(qū)。Ⅰ區(qū)分離出1～5號5條譜帶，電泳遷移率分別為0.700～0.944；Ⅱ區(qū)分離出6～11號電泳遷移率為0.531～0.649的5條譜帶；Ⅲ區(qū)分離出12～26號16條譜帶，電泳遷移率為0.321～0.522；Ⅳ區(qū)分離出27～39號13條譜帶，電泳遷移率為0.026～0.313。

2.1.1 雄性個體 大林姬鼠與黑線姬鼠雄性個體的血清蛋白譜帶分別為14條和19條。1號、21號、30號譜帶為大林姬鼠和黑線姬鼠共有譜帶，2號、4號、8號、9號、11號、16號、17號、19號、20號、27號、33號譜帶為雄性大林姬鼠特有帶，3號、5號、6號、7號、10號、12號、14號、15號、18號、23號、25號、28號、32號、35號、38號、39號譜帶為雄性黑線姬鼠特有帶；Ⅰ區(qū)共分離出6條帶，1號帶為雄性大林姬鼠與黑線姬鼠共有帶，活性相同，2號、4號譜帶為雄性大林姬鼠特有帶，活性4號>2號。3號、5號帶為雄性黑線姬鼠特有帶，活性5號>3號。Ⅱ區(qū)共有6號、7號、8號、9號、10號、11號共6條譜帶，8號、9號帶為雄性大林姬鼠特有帶，活性11號=9號>8號。6號、7號、10號帶為雄性黑線姬鼠特有帶，活性6號=7號>10號。Ⅲ區(qū)分離出12號、13號、14號、15號、16號、18號、19號、20號、21號、23號、25號、26號共12條帶，其中21號帶為雄性大林姬鼠和黑線姬鼠共有帶，且大林姬鼠活性高于黑線姬鼠。11號、16號、17號、19號、20號為雄性大林姬鼠特有帶，其活性20號>19號>17號=16號，12號、14號、15號、18號、23號、25號譜帶為雄性黑線姬鼠特有帶，活性25號>14號>18號>15號>23號。Ⅳ區(qū)共存在27號、28號、30號、32號、33號、35號、38號、39號的9條譜帶，其中30號譜帶為共有帶，且活性一致，27號、33號帶為雄性大林姬鼠特有帶，活性33號>27號，28號、32號、35號、38號、39號譜帶為雄性黑線姬鼠特有帶，活性28號>35號>33號>38號>39號，且39號帶為4個區(qū)域內(nèi)活性最弱。

2.1.2 雌性個體 大林姬鼠與黑線姬鼠雌性個體的血清蛋白譜帶分別為14條和12條。其中1號帶與21號帶為雌性大林姬鼠與黑線姬鼠共有帶，4號、8號、9號、11號、13號、20號、22號、24號、29號、30號、33號、36號帶為雌性大林姬鼠特有帶，3號、5號、7號、10號、14號、25號、26號、32號、34號、37號譜帶為雌性黑線姬鼠特有帶。Ⅰ區(qū)共存在5條帶，其中1號帶為共有帶活性一致，4號帶為雌性大林姬鼠特有且在此區(qū)域內(nèi)活性最強(qiáng)，3號、5號2條譜帶為雌性黑線姬鼠特有帶，活性5號>3號，5號帶在此區(qū)域內(nèi)活性與大林姬鼠特有的4號帶活性一致，為4個區(qū)域內(nèi)活性最強(qiáng)。Ⅱ區(qū)共分離出5條帶，8號、9號、11號譜帶為雌性大林姬鼠特有帶，活性11號=9號>8號，7號、10號帶為雌性黑線姬鼠特有帶，活性7號>10號。在Ⅲ區(qū)內(nèi)共分離出13號、14號、20號、21號、22號、24號、25號、26號9條帶，其中21號帶為雌性大林姬鼠與黑線姬鼠共有帶，且活性一致；13號、20號、22號、24號4條帶為雌性大林姬鼠特有帶，活性24號>20號>22號>13號；14號、25號、26號帶為雌性黑線姬鼠特有帶，活性25號=26號>14號。Ⅳ區(qū)內(nèi)共存在29號、30號、32號、33號、34號、36號、37號7條譜帶，其中29號、30號、33號、36號為雌性大林姬鼠特有帶，活性30號>29號>33號>36號，32號、34號、37號帶為雌性黑線姬鼠特有帶，其活性比較為32號>34號>37號。

注：從下至上順序是從陽極到陰極。

Note: The order from bottom to top was from anode to cathode.

圖 1大林姬鼠、黑線姬鼠血清蛋白質(zhì)的電泳圖譜

Fig.1 Electrophoresis map of serum protein ofA.peninsulaeandA.agrarius

表1 大林姬鼠、黑線姬鼠血清蛋白質(zhì)譜帶分布及電泳遷移率

注：表中“-”代表有條帶，下同。

Note:-represents stripes,The same below.

2.2 大林姬鼠、黑線姬鼠的組織蛋白電泳

由圖2、表2可知，大林姬鼠與黑線姬鼠的6個部位(心臟、肝臟、腎臟、肌肉、腦、肺臟)共分離出119條電泳譜帶，電泳遷移率為0.009～0.991。其中在心臟、肝臟、腎臟、肌肉、腦、肺臟6個部位大林姬鼠分別分離出44條、52條、30條、37條、41條、37條譜帶，黑線姬鼠分別分離出44條、48條、39條、37條、42條、38條譜帶。將組織蛋白電泳圖譜從陰極至陽極分為6個區(qū)域：Ⅰ區(qū)<43 KD，Ⅱ區(qū)為43～66.2 KD，Ⅲ區(qū)為66.2～97.4 KD，Ⅳ區(qū)為97.4～130 KD，Ⅳ區(qū)為97.4～130 KD，Ⅵ區(qū)：蛋白質(zhì)分子量>200 KD。

注：從下至上順序是從陽極到陰極，D為大林姬鼠，H為黑線姬鼠，下同。

Note: The order from bottom to top was from anode to cathode, D wasA.peninsulae, and H wasA.agrarius. The same below.

圖2大林姬鼠、黑線姬鼠組織蛋白質(zhì)電泳圖譜

Fig.2 Tissue protein electrophoresis map ofA.peninsulaeandA.agrarius

表2 大林姬鼠、黑線姬鼠組織蛋白質(zhì)譜帶分布及電泳遷移率

2.2.1 Ⅰ區(qū) 在Ⅰ區(qū)中共分離出1～40號40條譜帶，遷移率0.707～0.991。其中第40號譜帶為心臟、肝臟、肌肉、腦、肺臟5個組織共有帶；第31號帶為心臟、肝臟、腎臟、肌肉、肺臟5個組織共有帶；第12號譜帶為心臟、肝臟、腎臟、肌肉、腦5個組織共有帶，其中腎臟活性：黑線姬鼠>大林姬鼠；第38號譜帶為肝臟、肌肉、腦、肺臟4個組織共有帶；第37號譜帶為心臟、肝臟、腎臟、腦4個組織共有帶；第26號譜帶為肝臟、腎臟、肌肉、肺臟4個組織共有帶；第14號譜帶為肝臟、腎臟、肌肉、肺臟4個組織共有帶，其中腎臟活性：黑線姬鼠>大林姬鼠；30號譜帶為肝臟、腎臟、腦3個組織共有帶，其中腦組織蛋白活性：黑線姬鼠>大林姬鼠；第21號和18號譜帶為心臟、肌肉、肺臟3個組織共有帶，心臟電泳活性：21號>18號，肌肉電泳活性：18號>21號，肺臟電泳活性比較為21號>18號；第9號帶為肝臟、腎臟、肺臟3個組織所共有，其中腎臟電泳活性：黑線姬鼠>大林姬鼠；8號譜帶為心臟、腦、肺臟3個組織共有帶；7號帶為心臟、肝臟、腦3個組織共有帶；5號譜帶為肝臟、腎臟、腦3個組織共有帶，其中肝臟電泳活性：大林姬鼠>黑線姬鼠，腎臟電泳活性：黑線姬鼠>大林姬鼠；2號譜帶為腎臟、肌肉、肺臟3個組織共有帶；39號、17號譜帶為心臟、腎臟共有帶，其中39號譜帶腎臟為黑線姬鼠特有，心臟電泳活性：39號>17號；35號、27號、19號、16號譜帶為肝臟、腦共有帶，其中35號、27號譜帶肝臟電泳活性：27號>35號，35號腦組織蛋白電泳活性：黑線姬鼠>大林姬鼠，19號、16號譜帶肝臟電泳活性：大林姬鼠>黑線姬鼠，腦組織蛋白電泳活性：黑線姬鼠>大林姬鼠；第32號、13號、11號譜帶為心臟、腦共有帶，其中心臟電泳活性：13號>31號>11號，13號譜帶心臟電泳活性比較：大林姬鼠>黑線姬鼠，11號、13號腎臟電泳活性：黑線姬鼠>大林姬鼠；28號譜帶為肝臟、肺臟共有譜帶，20號譜帶為肝臟、腎臟共有譜帶，3號譜帶為腎臟、腦共有譜帶，其中腎臟和腦電泳活性：黑線姬鼠>大林姬鼠；第36號、10號、4號譜帶為肌肉特有帶，活性10號>36號>4號；25號、15號譜帶為心臟特有帶，活性：15號>25號；6號帶為肺臟特有，23號譜帶為腦特有帶，活性：黑線姬鼠>大林姬鼠，33號、29號、22號、1號譜帶為肝臟特有帶，其中33號與29號譜帶活性一致，1號和22號譜帶活性：大林姬鼠>黑線姬鼠，34號和24號譜帶為腎臟特有帶，其中34號譜帶活性：黑線姬鼠>大林姬鼠。

2.2.2 Ⅱ區(qū) 在Ⅱ區(qū)共分離出41～70號30條譜帶，遷移率為0.474～0.698，其中52號譜帶為肝臟、腎臟、肌肉、腦、肺臟5個組織共有帶；46號譜帶為心臟、肝臟、腦、肺臟4個組織共有帶；57號譜帶為肝臟、腎臟、肌肉、肺臟4個組織共有帶；60號譜帶為心臟、肝臟、肌肉、肺臟4個組織共有帶；62號譜帶為心臟、肝臟(大林姬鼠)、腎臟、肺臟(黑線姬鼠)4個組織所共有帶；65號譜帶為心臟、肝臟、腎臟(黑線姬鼠)、肌肉4個組織所共有帶；70號譜帶為心臟、肌肉、腦、肺臟4個組織共有帶；41號譜帶為肝臟、腎臟、肌肉3個組織特有帶，其中腎臟活：黑線姬鼠>大林姬鼠；42號譜帶為肝臟、腦、肺臟3個組織共有帶；44號譜帶為肝臟(大林姬鼠)、肌肉、腦3個組織共有帶；48號譜帶為心臟、腎臟、腦3個組織共有帶；56號譜帶心臟、肝臟、肌肉3個組織共有帶；67號譜帶為心臟、肝臟、腦(黑線姬鼠)3個組織共有帶；43號、58號譜帶為心臟、腦2個組織共有帶，其中心臟活性：43號>58號，腦組織蛋白活性比較為58號(黑線姬鼠)>58號(大林姬鼠)=43號；47號譜帶為肝臟、肺臟2種組織共有帶；54號譜帶為腦(黑線姬鼠)、肺臟共有帶；63號譜帶為肌肉、腦臟2種組織共有帶；45號、55號、64號、69號譜帶為腎臟特有，其中64號譜帶為黑線姬鼠特有帶，55號譜帶活性：黑線姬鼠>大林姬鼠，69號、45號譜帶活性：69號>45號；49號、51號、59號、66號譜帶為肝臟特有帶，其中49號譜帶為大林姬鼠特有帶，51號、59號、66號譜帶活性：51號>59號>66號；第50號、61號譜帶為腦組織蛋白特有帶，其活性：50號>61號；第53號、68號譜帶為心臟、肌肉2種組織特有，其活性一致。

2.2.3 Ⅲ區(qū) 在Ⅲ區(qū)共分離出71～86號16條譜帶，遷移率為0.323～0.19，其中，86號譜帶為肝臟、腎臟、肌肉、腦、肺臟5個組織共有帶，腦組織蛋白譜帶活性為黑線姬鼠>大林姬鼠；84號譜帶為心臟、肝臟、肌肉、肺臟4個組織共有帶；82號譜帶為肝臟、腎臟、肌肉、肺臟4個組織共有帶，其中腎臟為黑線姬鼠特有；75號譜帶為心臟、肝臟、腎臟、肺臟4個組織共有譜帶，其中腎臟為黑線姬鼠特有；80號譜帶為肝臟、腎臟共有帶；79號譜帶為肝臟、肌肉共有譜帶；74號譜帶為心臟、肌肉共有帶；72號譜帶為肝臟、腎臟共有帶；85號、78號、76號譜帶分別為心臟、肌肉、肺臟特有；71號、73號、77號、81號、83號譜帶為腦組織蛋白特有帶，其活性：83號(黑線姬鼠)=73號=71號>83號(大林姬鼠)>77號>81號。其中73號帶為大林姬鼠特有帶，83號帶活性：黑線姬鼠>大林姬鼠。

2.2.4 Ⅳ區(qū) 在Ⅳ區(qū)共分離出87～102號16條譜帶，遷移率0.319～0.187，其中102號帶為心臟、腎臟、肌肉、肺臟4個組織共有帶；99號譜帶為肝臟、腎臟、肌肉、腦4個組織共有帶；97號譜帶為心臟、肝臟、肌肉、腦4個組織的共有帶，其中肝臟部位為大林姬鼠特有帶；90號譜帶為心臟、肝臟、腎臟、腦4個組織共有帶；第88號帶為心臟、腦、肺臟3個組織共有帶；95號譜帶為肝臟和腎臟共有帶；93號譜帶為心臟、肺臟共有帶；96號、92號、87號譜帶為肌肉特有帶，其活性：87號=96號<92號；98號、89號譜帶為肺臟特有帶，活性：98號>89號。94號、100號、101號帶為腦、肝臟、心臟3個組織特有帶；102號、99號譜帶腎臟部位譜帶為黑線姬鼠特有，91號譜帶也為黑線姬鼠腎臟特有帶，其活性比較為102號=99號>91號。

2.2.5 Ⅴ區(qū) 在Ⅴ區(qū)分離103～111號9條譜帶，遷移率0.185～0.095。其中111號帶為肝臟、腎臟、肌肉、肺臟共有譜帶，在腎臟處為黑線姬鼠特有帶；110號帶為肝臟、腦2種組織共有帶；109號帶為心臟、腦2種組織共有帶；108號帶為肝臟、肺臟2種組織共有帶；103號帶為腦組織蛋白特有帶，活性：黑線姬鼠>大林姬鼠；107號、106號、105號、104號四條譜帶為心臟特有帶，活性：104號>105號=106號>107號。

2.2.6 Ⅵ區(qū) 在Ⅵ區(qū)分離出112～119號8條譜帶，遷移率0.086～0.009。其中116號譜帶為心臟、腎臟、腦、肺臟4種組織共有帶；18號譜帶為腎臟和肌肉2種組織所共有；114號譜帶為腎臟和肺臟共有帶，119號帶為肌肉組織蛋白特有帶，117號、112號帶為腦特有帶，其活性112號>117號，113號、115號帶為肝臟特有帶，其活性一致。

3 結(jié)論與討論

大林姬鼠與黑線姬鼠雌、雄個體之間血清蛋白的譜帶數(shù)量和譜帶分布相類似，但活力活性存在著顯著差別。這與雌、雄個體間的體貌特征、生理結(jié)構(gòu)、雌雄激素的分泌水平密切相關(guān)。大林姬鼠與黑線姬鼠同為姬鼠屬，但綜合比較兩者雄性個體間和雌性個體間血清蛋白電泳譜帶總數(shù)、譜帶的寬度、顏色深淺等方面分析，兩者差異較大，主要表現(xiàn)在：大林姬鼠與黑線姬鼠雌性個體血清蛋白譜帶有明顯差異，在清蛋白區(qū)黑線姬鼠雌雄個體均有前清蛋白，而大林姬鼠只有雄性個體出現(xiàn)前清蛋白，雌性大林姬鼠未出現(xiàn)；在球蛋白區(qū)，大林姬鼠與黑線姬鼠雄性個體分離出11條和16條電泳譜帶，大林姬鼠與黑線姬鼠雌性個體分離出12條和9條電泳譜帶。球蛋白與機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)[2]，在球蛋白區(qū)2種姬鼠表現(xiàn)的譜帶特征說明，雄性黑線姬鼠相比于雄性大林姬鼠有較強(qiáng)的抗逆性；而雌性黑線姬鼠的抗逆能力低于雌性大林姬鼠。

由大林姬鼠與黑線姬鼠的組織蛋白電泳圖譜可以看出：大林姬鼠與黑線姬鼠各組織蛋白電泳譜帶相似，但在肝臟、腎臟、腦、肺臟4個器官通過電泳譜帶存在差異，其中大林姬鼠肝臟電泳譜帶數(shù)量較黑線姬鼠肝臟電泳譜帶數(shù)多4條，在腎臟電泳譜帶數(shù)黑線姬鼠比大林姬鼠多9條，在腦臟和肺臟部位黑線姬鼠比大林姬鼠多1條譜帶。

大林姬鼠與黑線姬鼠不同性別個體間的差別與形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理機(jī)能以及雌雄激素分泌水平的高低密切相關(guān)。在生物體中，蛋白質(zhì)是生命體的重要表現(xiàn)形式，是基因的生物化學(xué)表現(xiàn)型，其表達(dá)受到基因的調(diào)控和外界環(huán)境的共同作用，因此同一物種雌、雄個體血清蛋白之間和不同物種個體間的組織蛋白的差異與基因的表達(dá)水平密切相關(guān)。大林姬鼠與黑線姬鼠親緣關(guān)系較近，但綜合兩者同一性別的血清蛋白和組織蛋白電泳譜帶分布、數(shù)量、活性等方面分析，兩者存在明顯的差異。