吳治明 汪中明 李春曉 郭曉霞 閻 婷王 剛 朱小娟 張恒端 董言德 趙彤言**

(1.安徽醫(yī)科大學，合肥 230032；2. 軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071)

流行性乙型腦炎(Japanese encephalitis，乙腦)是由蚊蟲傳播的病毒性疾病，主要引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害。它的病原體是黃病毒科(Flaviviridae)、黃病毒屬(Flavivirus)的乙型腦炎病毒( Japanese encephalitis virus， JEV )。我國除新疆、西藏、青海外均為乙腦疫區(qū)，主要病例發(fā)生在兒童，病死率較高，后遺癥嚴重，目前雖已有疫苗可供預防，但局部地區(qū)仍時有暴發(fā)或流行(郭楊等，2008；郭海強等，2011)，對媒介蚊蟲的控制仍是預防乙腦的關(guān)鍵措施。

三帶喙庫蚊Culextritaeniorhynchus是我國乙腦的主要傳播媒介(王逸民等，1990)。在媒介蚊蟲的防治中，化學防治因具有實施方便、見效快等特點而得到廣泛應用(陸寶麟，2000)。三帶喙庫蚊孳生地多為稻田，廣泛接觸農(nóng)業(yè)用殺蟲劑，由于殺蟲劑的連續(xù)大量使用，加之蚊蟲世代歷期短、繁殖力強等因素，導致了三帶喙庫蚊抗藥性的發(fā)生和發(fā)展。目前我國很多地區(qū)三帶喙庫蚊已經(jīng)對多種殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗性(周明浩等，2006；劉洪霞等，2008；孫養(yǎng)信等，2009a，2009b，2011；楊維芳等，2011)。

隨著對多種與蚊蟲抗性相關(guān)解毒代謝酶類的深入研究，已分離和鑒定出多種與抗性相關(guān)的基因，人們逐漸認識到，蚊蟲往往從多個生理途徑進化出一系列復雜的機制來抵御某種藥物侵害(McCarrolletal.， 2001；Hemingwayetal.， 2000a；崔峰等， 2007)，而這些機制的產(chǎn)生會給蚊蟲帶來某些生理生化特性的改變。對致倦庫蚊敏感品系和抗性品系的研究發(fā)現(xiàn)，抗性蚊蟲的酯酶在中腸、真皮層、馬氏管、唾液腺等組織中高量表達，改變了細胞的氧化還原能力(Hemingwayetal.， 2000b)。細胞氧化還原能力的改變，可能會改變中腸結(jié)構(gòu)細胞表面電荷的分布從而阻止病毒對細胞的感染及病毒穿過中腸向血淋巴的釋放，最終會影響蚊蟲的媒介效能。研究還發(fā)現(xiàn)，擬除蟲菊酯抗性蚊蟲通過升高谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶含量來減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，使昆蟲組織免受氧化性損傷，可能會有利于病原體的存活；相反，P450單加氧酶含量的升高，增加細胞的氧化作用而不利于病原體的存活(Vontasetal.， 2001)。這些研究表明殺蟲劑抗性的產(chǎn)生，有可能促進或抑制疾病的傳播。

本研究通過野外采集不同種群三帶喙庫蚊，測定其對兩種常用擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性水平，同時進行乙型腦炎病毒的感染實驗。以期了解自然環(huán)境中三帶喙庫蚊抗藥性水平與其對乙腦病毒的易感性之間的關(guān)系，對乙腦的防治具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗蟲株: 三帶喙庫蚊的實驗室品系(LAB)由陜西省疾病預防控制中心引進，野外采集后連續(xù)飼養(yǎng)3年多，未接觸任何殺蟲劑。野外種群是在2011年7～8月采集的陜西安康建民種群(AKJM)(32°42′57″N，108°56′42″E)、江蘇南京江浦種群(NJJP)(32°01′18″N，118°28′54″E)和安徽濉溪南坪種群(SXNP)(33°50′16″N，116°88′53″E)。采集場所均為養(yǎng)豬場，用電動吸蚊器多次采集飽血后的三帶喙庫蚊成蚊，帶回養(yǎng)蟲室產(chǎn)卵孵化，利用繁殖的第1代(安康建民種群有F1和F3代)進行生物測定和感染實驗。養(yǎng)殖條件：溫度26±1 ℃、相對濕度75%±5%、光照14 h/d。

1.1.2實驗用鼠：昆明(KM)乳鼠，1～3日齡時對病毒最敏感，用于病毒的鼠腦傳代； KM小鼠，成年，用于采新鮮鼠血，以上實驗用昆明鼠均購于軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。

1.1.3病毒：乙型腦炎病毒(GenBank No.L48961)毒種由本所菌毒種保藏中心提供。

1.1.4質(zhì)粒和菌株:pMD18-T Vector購自寶生物工程(大連)有限公司；宿主菌大腸桿菌E.coliXL1-blue，本實驗室保存。

1.1.5工具酶和主要試劑:溴氰菊酯(98.7%)和高效氯氰菊酯(99.0%)購自北京市和力順科技有限公司，DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，Trizol Reagent購自Invitrogen公司，RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0、Premix Version 2.0(Loading dye mix)、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver 2.0試劑盒、DNA分子量標準DL 2000和限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)，IPTG和X-gal購自上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司，質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖匈徸员本┎┐筇┛斯?。

1.2 實驗方法

1.2.1幼蟲半數(shù)致死濃度(LC50值)測定:對實驗室品系及野外種群的幼蟲做毒力測定。采用浸漬法(劉維德，1983)，將殺蟲劑母液用丙酮配制成5～7個濃度，容器中加199 mL過夜清水，放入30頭Ⅲ齡末Ⅳ齡初幼蟲，加1 mL不同梯度濃度的藥液，1 mL丙酮作對照，重復3次，24 h后觀察結(jié)果，以幼蟲不能逃避機械刺激為死亡。將存活個體在-70 ℃條件下保存，用于后續(xù)實驗。用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，記錄處理蟲數(shù)。通過分析獲得致死中濃度LC50值及其95%置信限(95% CI)。由于實驗室品系三帶喙庫蚊未完全回復到敏感狀態(tài)，三帶喙庫蚊敏感品系幼蟲對常用殺蟲劑的LC50值參考以往文獻記錄數(shù)值(表1)(陳美文，1984; 張淑媛，1993)。

1.2.2三帶喙庫蚊經(jīng)口感染乙腦病毒: (1)10%病毒鼠腦懸液的制備：取1窩1～3日齡的健康KM乳鼠，腦內(nèi)接種病毒，每只0.03 mL，接種完成后放回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)，24 h內(nèi)無非特異性死亡。逐日觀察乳鼠生長情況，待乳鼠出現(xiàn)散窩、抽搐、弓背等發(fā)病癥狀，用75%酒精對發(fā)病乳鼠體表消毒后進行無菌解剖取鼠腦，加入DMEM培養(yǎng)液冰上研磨，制成10%的病毒鼠腦液(每個鼠腦重量約為0.2 g)，12 000 r/min，離心10 min，取上清為病毒鼠腦懸液，沉淀作為陽性樣本，于-70℃凍存。(2)經(jīng)口感染：在感染實驗前一晚將一定量羽化3～5 d的三帶喙庫蚊吸入小蚊籠中，斷糖水。取成年的健康KM鼠，眼球取血共4 mL，加入1%的肝素鈉抗凝劑防止凝血。將病毒鼠腦懸液、新鮮鼠血、8%過濾糖水按1∶1∶1體積配成12 mL病毒血餐，37℃水浴，另配制一份由DMEM培養(yǎng)液替代病毒鼠腦懸液的血餐，作為陰性對照。將海綿剪成適當大小，浸透血餐后盛放于小平皿中，放入小蚊籠中供蚊子吸血1 h。將小蚊籠放入手套隔離器中，挑選飽血雌蚊放入透明塑料杯中，以細密紗布封口，1只/杯。于26±1℃，相對濕度75%±5%，光照14 h/d環(huán)境中，以3%的糖水喂養(yǎng)，10 d后收樣。將隔離器中剩余的蚊蟲凍死，挑出飽血雌蚊凍存于-70℃，標記為0 d樣本。陰性對照組的蚊蟲直接飼育10 d后收樣。

1.2.3RT-PCR檢測蚊蟲體內(nèi)病毒核酸：(1)引物設計與合成：根據(jù)文獻資料 (方美玉等，1997)，使用Primer primier 6.0軟件，設計了1對乙腦病毒通用引物。上游引物P101：5′-GTCAACCCCATAACTCTCACAGC-3′，下游引物P102：5′-ACGCAGAGGACTAGGAGCATTAC-3′，目的片段長度為1 227 bp。引物由賽百盛生物工程公司合成，用無RNA酶的水配成10 μmol/L應用濃度，于-20℃凍存?zhèn)溆谩?2)成蚊總RNA的提取:取單頭雌蚊，采用Invitrogen公司Trizol試劑提取三帶喙庫蚊總RNA(按操作手冊進行)。提取的總RNA溶解于適量DEPC處理的無菌水中，立即進入cDNA第1鏈的合成。(3)反轉(zhuǎn)錄反應(RT反應): 反應體積20 μL，其中蚊RNA 2 μL ，25 mmol/L MgCl24 μL，10×RT Buffer 2 μL，RNase Free ddH2O 7.5 μL，各10 mmol/L dNTP Mixture 2 μL，40 U/μL RNase Inhibitor 0.5 μL，200 U/μL AMV Reverse Transcriptase 1 μL，50 pmol/μL Random 9 mol/μL，按以下條件進行：30 ℃，10 min；42 ℃，30 min，95 ℃，5 min；5 ℃，5 min。立即進入PCR擴增反應。 (4) PCR擴增: 反應總體積 50 μL，包括cDNA模板(RT反應產(chǎn)物)4 μL，Premix Taq 25 μL，10 mmol/L P101 2.0 μL，10 mmol/L P102 2.0 μL，ddH2O 17 μL。反應條件為: 94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，50 ℃，30 s，72 ℃，1 min，35個循環(huán)；72 ℃，7 min。(5) PCR 產(chǎn)物純化：按Agarose Gel DNA Purification Kit Ver 2.0 試劑盒(TaKaRa公司產(chǎn)品)說明書純化回收PCR 產(chǎn)物。(6)克隆并測序：PCR純化產(chǎn)物克隆入pMD18-T載體(TaKaRa)，轉(zhuǎn)化宿主菌XL-blue 1，在X-Gal和IPTG的存在下，經(jīng)過藍白斑篩選，PCR鑒定及酶切鑒定，挑選陽性克隆菌液送至上海生工公司進行測序，將所得的核酸序列進行去載體、拼接、去冗余處理后，將結(jié)果與美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中的部分已知物種核酸序列進行相似性比對。(7)電泳檢測陽性樣本：以DNA DL2000 Marker作為分子量標準，取5 μL PCR反應產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析，記錄陽性樣本數(shù)。

1.2.4統(tǒng)計與計算：用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，記錄處理蟲數(shù)。通過分析獲得致死中濃度(LC50值)及其95%置信限(95%CL)、斜率值(slope)、標準誤(SE)、卡方值(χ2)、自由度(df)。計算抗性指數(shù)，抗性指數(shù)(R/S)=野外種群LC50/參考敏感品系LD50。

2 結(jié)果

2.1 三帶喙庫蚊幼蟲對兩種常用擬除蟲菊酯類殺蟲劑的生物測定結(jié)果

本研究采用浸漬法，測定了各種群三帶喙庫蚊幼蟲對溴氰菊酯和高效氯氰菊酯的半數(shù)致死濃度(LC50值)。結(jié)果表明，三帶喙庫蚊幼蟲實驗室品系、南京江浦種群F1代、濉溪南坪種群F1代、安康建民種群F1代和F3代對溴氰菊酯的LC50值分別為0.0009、0.0071、0.0160、0.0027和0.0025 mg/L，與參考的敏感品系數(shù)據(jù)相比，抗藥性指數(shù)從2.30至40.05倍不等；對高效氯氰菊酯的LC50值分別為0.0043、0.0117、0.0528、0.0121和0.0141 mg/L，與參考的敏感品系數(shù)據(jù)相比，抗藥性指數(shù)從2.13～26.42倍不等?？梢?，各自然種群三帶喙庫蚊幼蟲對兩種殺蟲劑均產(chǎn)生了不同程度的抗性(表1)。

2.2 各地三帶喙庫蚊對乙腦病毒的易感性

采用經(jīng)口感染的方法，對實驗室品系和3個野外種群的三帶喙庫蚊進行了乙腦病毒的感染實驗。三帶喙庫蚊吸食7.3 logPFU/mL 的乙腦病毒血餐10 d后，用RT-PCR方法檢測蚊蟲體內(nèi)病毒，檢測的片段經(jīng)克隆、測序比對之后確定為乙腦病毒。結(jié)果顯示：三帶喙庫蚊實驗室品系、南京江浦種群F1、濉溪南坪種群F1代、安康建民種群F1代和F3代對乙腦病毒感染率分別為84.44%、80.56%、62.50%、86.00%和91.89%(圖1，表2)。

2.3 三帶喙庫蚊抗性水平與其對乙腦病毒易感性的相關(guān)性分析

將三帶喙庫蚊對兩種常用擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗藥性指數(shù)與其對乙腦病毒的感染率作相關(guān)性分析，得到如下結(jié)果：三帶喙庫蚊幼蟲對溴氰菊酯和高效氯氰菊酯的抗性水平與其對乙腦病毒的易感性的相關(guān)性明顯。其中三帶喙庫蚊對乙腦病毒的感染率越低，其幼蟲對溴氰菊酯的抗性指數(shù)越高(P=0.0167<0.05)，相關(guān)系數(shù)為0.887，回歸方程為：y=-1.295x+119.5(圖2)；同樣，對乙腦病毒的感染率越低，其對高效氯氰菊酯的抗性指數(shù)也越高(P=0.0460<0.05)，相關(guān)系數(shù)為0.783，回歸方程為：y=-0.765x+71.52(圖3)。

表1 各種群三帶喙庫蚊對2種常用擬除蟲菊酯類殺蟲劑的致死中濃度(LC50)測定及抗藥性指數(shù)Tab.1 Resistance characteristics(LC50&R/S) of the different populations of Culex tritaeniorhynchus larva

注：SS：參考敏感品系；LAB：實驗室種群；NJJPF1：南京江浦種群F1代；AKJMF1：安康建民種群F1代；AKJMF3：安康建民種群F3代；SXNPF1：濉溪南坪種群F1代。抗性指數(shù)(R/S)=野外種群LC50/參考敏感品系LD50。下同。

Note:RS:Reference sensitive population；LAB:Laboratory population；NJJPF1:F1 of Nanjing jiangpu population；AKJMF1:F1 of Ankang jianmin population；AKJMF3:F3 of Nanjing jiangpu population；SXNPF1: F1 of Suixi nanping population. Resistant ratio(R/S)=LC50of Resistant strain/LC50of sensitive strain. The same below.

圖1 感染實驗中三帶喙庫蚊樣本感染乙腦病毒(JEV)的PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of Japanese encephalitis virus in Culex tritaeniorhynchusM：DL2000分子量標準；1：JEV鼠腦懸液；2：正常三帶喙庫蚊(陰性對照)；3：感染JEV 0 d的三帶喙庫蚊；4，5，6：感染JEV 10 d的三帶喙庫蚊.M： DL2000 DNA Marker；1：Mix liquid with Japanese encephalitis virus；2：Normal Cx. tritaeniorhynchus；3：Cx. tritaeniorhynchus infected orally by Japanese encephalitis virus 0 day；4，5，6：Cx. tritaeniorhynchus infected orally by Japanese encephalitis virus 10 days later.

表2 三帶喙庫蚊成蚊對乙腦病毒的易感性Tab.2 Susceptibility of Culex tritaeniorhynchus infected orally by Japanese encephalitis virus

感染率=陽性個體數(shù)/檢測個體總數(shù)×100%。

Infection rate=number of positive individuals/total number of detection individuals×100%.

圖2 三帶喙庫蚊幼蟲對溴氰菊酯抗藥性指數(shù)與其對乙腦病毒感染率的相關(guān)性Fig.2 Correlation relationship between R/S of larval mosquito to deltapermethrin and infection rate of Culex tritaeniorhynchus infected orally by Japanese encephalitis virus(P=0.0167)

圖3 三帶喙庫蚊幼蟲對高效氯氰菊酯抗藥性指數(shù)與其對乙腦病感染率的相關(guān)性Fig.3 Correlation relationship between R/S of larval mosquito to beta-cypermethrin and infection rate of Culex tritaeniorhynchus infected orally by Japanese encephalitis virus(P=0.0460)

3 討論

蚊蟲抗性的發(fā)生和發(fā)展受遺傳、生物學、藥劑和環(huán)境等方面因素的影響(唐振華等，2000；Nkyaetal.， 2013)。在多種因素共同作用下，蚊蟲對于殺蟲劑的抗性水平千差萬別。本研究根據(jù)對我國少數(shù)幾個地區(qū)三帶喙庫蚊幼蟲生物測定的結(jié)果，結(jié)合以往各地的調(diào)查數(shù)據(jù)(周明浩等，2006；劉洪霞等，2008；孫養(yǎng)信等，2009a，2009b，2011；楊維芳等，2011)表明：我國許多地區(qū)的三帶喙庫蚊已經(jīng)對多種殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度抗性。具體表現(xiàn)為不同種類殺蟲劑的抗性水平不同，對有機磷類和氨基甲酸酯類殺蟲劑抗性水平較高，對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性水平相對較低；不同地理種群三帶喙庫蚊對同一種殺蟲劑的抗性水平不同，可能與殺蟲劑的使用劑量和頻率有關(guān)。

媒介蚊蟲對蟲媒病毒的易感性受到包括蚊蟲的遺傳背景因素、蟲媒病毒的因素(滴度、毒力和血清型等)、環(huán)境因素(溫度、濕度等)、蚊蟲營養(yǎng)和個體大小等多種因素的影響(周光智等，2003)。蚊蟲在長期的化學殺蟲劑選擇壓力下，已從多個生理途徑進化出抵抗這種選擇壓力的能力，而且這種能力是可以遺傳的。根據(jù)抗性分子機制不同，蚊蟲抗藥性主要分為代謝解毒和靶標敏感。參與解毒代謝的酶類主要通過基因擴增和活性升高等方式抵抗殺蟲劑，而靶標蛋白類主要通過基因突變，最終導致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變的方式抵抗殺蟲劑的作用。這些改變發(fā)生的同時，也改變細胞表面電荷的分布和神經(jīng)遞質(zhì)的正常傳遞，影響了蚊蟲細胞的氧化還原能力，改變了蚊蟲的生理生化功能(崔峰等， 2007)。蚊蟲生理生化功能的改變，可能促進或抑制其對疾病的傳播。因此，在媒介蚊蟲的防治中，了解抗藥性對蚊蟲媒介效能的影響就顯得尤為重要。

由于自然環(huán)境中蚊蟲接觸的殺蟲劑種類繁多，其抗藥性的產(chǎn)生是多種機制共同作用的結(jié)果，通過研究野外種群三帶喙庫蚊抗性水平與其對乙腦病毒易感性的相關(guān)性，更能反映自然環(huán)境中的真實情況。我們的研究結(jié)果顯示：各野外種群三帶喙庫蚊幼蟲對溴氰菊酯的抗性指數(shù)越高，其對乙腦病毒的感染率越低(P=0.0167<0.05)；對高效氯氰菊酯的抗性指數(shù)越高，其對乙腦病毒的感染率也越低(P=0.0460<0.05)。表明三帶喙庫蚊在殺蟲劑的選擇壓力下，其對乙腦病毒的易感性可能會受到一定的影響，但這種影響的機制尚待進一步研究。