楊 雷，漆世華，溫文生，李玉萍，王煥君，謝紅玲

(武漢中博生物股份有限公司，武漢430070)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)主要引起妊娠母豬繁殖障礙和仔豬的呼吸道疾病及免疫抑制和持續(xù)性感染，死亡率不斷升高[1-2]。1996年郭寶清等[3]首次從國內(nèi)疑似豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)感染豬群中分離出PRRSV，從而證實(shí)了本病在我國的存在。PRRSV是動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬的單股正鏈RNA病毒。其全基因組長約15 kb，含有9個(gè)開放閱讀框(ORFs)，0RFla和0RFlb編碼蛋白聚合酶，ORF 2～7分別編碼結(jié)構(gòu)蛋白GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、M 和 N 蛋白[4]。其中，N蛋白也稱核衣殼蛋白，由0RF7編碼，在病毒粒子中含量較高，N基因高度保守。N蛋白約15 kD，至少有5個(gè)抗原決定簇，其中包括兩型的共同決定簇和特異性決定簇，具有一個(gè)糖基化位點(diǎn)，但它不是?糖基化蛋白。N蛋白的C端在維持蛋白構(gòu)象上起重要作用。其N端半段是由Arg、Lys、His 3中堿性氨基酸組成，可能和RNA基因組間的相互作用有關(guān)。N蛋白之間形成同源二聚體，對(duì)病毒的組裝至關(guān)重要，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫作用[5]。GP5蛋白約25 kD，由0RF5編碼，是一個(gè)糖基化蛋白，含有4個(gè)糖基化位點(diǎn)，且非常不保守，三次跨膜，并有一個(gè)70個(gè)氨基酸殘基的胞外區(qū)。有6個(gè)抗原決定簇，有證據(jù)表明GP5在PRRSV的抗體識(shí)別過程中起關(guān)鍵作用，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要結(jié)構(gòu)蛋白，病毒中和作用與抗GP5抗體效價(jià)呈顯著相關(guān)性，同時(shí) GP5還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是公認(rèn)的PRRSV的主要保護(hù)性抗原[6]。

目前用于預(yù)防PRRS的疫苗主要是傳統(tǒng)疫苗——弱毒苗和滅活苗。盡管弱毒疫苗能夠提供較好的免疫保護(hù)，但存在毒力返強(qiáng)和散毒的危險(xiǎn)[7]。而滅活疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平很低，且極不穩(wěn)定。因此，研發(fā)確實(shí)、可靠、高效的新一代疫苗也是未來一個(gè)方向。本研究利用桿狀病毒雙表達(dá)載體(pFastBacTMDual)同時(shí)表達(dá)HP-PRRSV GP5蛋白和N蛋白，以期更好的發(fā)揮PRRSV GP5、N抗原活性及協(xié)同作用，為PRRSV基因工程疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 載體、細(xì)胞、菌株與病毒 桿狀病毒載體pFastBacTMDual、昆蟲 Sf9 細(xì)胞、E．coli DH10Bac購于美國Invitrogen公司。高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒廣東分離株(PRRSV GD)由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶、PCR相關(guān)試劑為TaKaRa公司產(chǎn)品;Cellfectin?ⅡReagent為Invitrogen公司產(chǎn)品;抗PRRSV N蛋白的鼠單克隆抗體為美國VMRD公司，Prod:P080728-004;抗PRRSV GP5蛋白的兔多抗為英國ABCAM公司，Prod:RS-4504R;PRRSV GP5抗體檢測試劑盒為法國LSI公司，Batch:5-VRTPRA-028;PRRSV N抗體檢測試劑盒為美國IDEXX公司，Prod:Z411。

1.3 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增 參照PRRSV GD株(GenBank登錄號(hào):EU109503.1)ORF7和ORF5基因的序列，各設(shè)計(jì)一對(duì)針對(duì)PRRSV GD毒株N和GP5蛋白基因的特異性引物，擴(kuò)增N蛋白基因帶BamHⅠ酶切位點(diǎn)的上游引物 NF:5’-GGATCCATGCCAAATAACAACGGCAAGC-3’和帶 HindⅢ酶切位點(diǎn)的下游引物 NR:5’-AAGCTTTCATGCTGAGGGTGATGCTGTG-3’;擴(kuò)增 GP5蛋白基因帶XhoⅠ酶切位點(diǎn)的上游引物GP5F:5’-CTCGAGATGTTGGGGAAGTGCTTGACC-3’和帶 KpnⅠ酶切位點(diǎn)的下游引物 GP5R:5’-GGTACCCTAGAGACGACCCCATCGTTC-3’，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

按照TakaR RNA試劑盒說明書提取PRRSV GD株RNA，以oligo(dT)為引物，以M-MLV進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄;然后以cDNA產(chǎn)物為模板，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增出PRRSV GD毒株的N和GP5全基因;N和GP5基因的擴(kuò)增條件均為:94℃ 5 min;94℃ 40 s，60 ℃ 40 s，72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳。

1.4 重組桿狀Bac-N-GP5病毒的制備 將PCR擴(kuò)增的N蛋白基因和GP5蛋白基因通過酶切及酶連接的方式插入桿狀病毒載體pFBD(pFast-BacTMDual的縮寫)中，獲得含有 N蛋白基因和GP5蛋白基因的重組桿狀病毒載體pFBD-NGP5。N蛋白基因通過polyhedrin啟動(dòng)子調(diào)控，GP5基因由p10啟動(dòng)子直接調(diào)控，其構(gòu)建示意圖見圖1。

按照Invitrogen說明書將上述重組載體pFBDN-GP5通過 Bac-to-Bac系統(tǒng)(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)轉(zhuǎn)入 DH10Bac E．coli，進(jìn)行菌內(nèi)同源重組。用卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素篩選獲得重組病毒DNA，PCR鑒定，然后將正確的重組病毒DNA用Cellfectin?ⅡReagent傳染SF9細(xì)胞，培養(yǎng)3～4 d，獲得重組的桿狀病毒Bac-N-GP5。

圖1 重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

1.5 IFA檢測重組桿狀病毒Bac-N-GP5的表達(dá)

重組桿狀病毒Bac-N-GP5接種Sf9細(xì)胞72 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞兩次，80%(V/V)冷丙酮固定細(xì)胞 20 min，PBS洗三次，加鼠抗PRRSV N/兔抗PRRSV GP5抗體 (1∶100)37℃作用1 h，PBS洗三次，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗鼠二抗/羊抗兔二抗(1∶500)37 ℃作用1 h，PBS 洗三次，50%(V/V)甘油封片，熒光顯微鏡觀察。

1.6 Western blot檢測 將感染重組桿狀病毒的細(xì)胞裂解液通過12%SDS-PAGE電泳分離蛋白，采用半干轉(zhuǎn)移(Bio-Rad)轉(zhuǎn)印硝酸纖維膜，并設(shè)細(xì)胞裂解液作為空白對(duì)照。用含5%脫脂乳的PBST封閉過夜，分別以 N和 GP5蛋白的抗體為一抗，1∶1000稀釋，室溫孵育1 h;辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG和羊抗兔IgG為二抗，1∶1000稀釋，室溫孵肓1 h。用DAB顯色液進(jìn)行顯色作用。

1.7 重組桿狀病毒在小鼠中的免疫原性測定 用感染重組桿狀病毒的細(xì)胞裂解液以鋁佐劑為佐劑，于0和14 d免疫小鼠，于免疫后7、14、21、28 d采集小鼠血清，用ELISA測定抗N蛋白和抗GP5蛋白的抗體水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組桿狀病毒Bac-N-GP5的構(gòu)建與鑒定

通過RT-PCR擴(kuò)增得到了ORF7和ORF5基因，將其克隆入桿狀病毒表達(dá)載體pFBD中，獲得重組質(zhì)粒pFBD-N-GP5。經(jīng)PCR鑒定表明基因N和GP5克隆到桿狀病毒表達(dá)載體pFBD中(圖2)，測序表明該重組質(zhì)粒的讀碼框正確。

圖2 PCR檢測重組質(zhì)粒pFBD-N-GP5

2.2 IFA鑒定重組桿狀病毒的表達(dá) 用針對(duì)PRRSVN和GP5蛋白的抗體進(jìn)行IFA試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組桿狀病毒感染的細(xì)胞出現(xiàn)明顯的熒光，而對(duì)照組則看不到熒光(圖3)。證明N蛋白和GP5蛋白可以在重組桿狀病毒中共同表達(dá)。

2.3 重組桿狀病毒W(wǎng)estern blot分析 重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞后經(jīng)Western blot檢測，結(jié)果見圖4?？筃蛋白抗體和抗GP5蛋白的抗體分別檢測到約為15 kD的N蛋白和25 kD的GP5蛋白條帶。證實(shí)N和GP5重組蛋白在Sf9細(xì)胞中表達(dá)成功。

2.4 重組桿狀病毒在小鼠中的免疫原性測定 用感染重組桿狀病毒的細(xì)胞裂解液以鋁佐劑為佐劑，于0和14 d免疫小鼠，于免疫后7、14、21、28 d采集小鼠血清，分別用抗PRRSV N蛋白和GP5蛋白的抗體ELISA檢測試劑盒對(duì)免疫后的血清中的N蛋白產(chǎn)生的抗體和GP5蛋白產(chǎn)生的抗體進(jìn)行測定，結(jié)果表明免疫組血清抗N蛋白和抗GP5蛋白的抗體在14 d開始升高，21和28 d的抗體值明顯高于對(duì)照組(圖5、圖6)，說明重組桿狀病毒表達(dá)的N和GP5蛋白對(duì)小鼠能夠產(chǎn)生很好免疫原性。關(guān)于重組桿狀病毒對(duì)本屬動(dòng)物豬的免疫和攻毒保護(hù)效果還有待于進(jìn)一步研究。

圖3 重組桿狀病毒表達(dá)N和GP5蛋白的間接免疫熒光檢測

3 討論

目前PRRS的防治主要依靠傳統(tǒng)疫苗，即弱毒疫苗和滅活苗，但由于這些疫苗均存在不同程度的缺陷，主要是免疫效果不理想。此外，活疫苗還存在毒力返強(qiáng)和散毒的危險(xiǎn)等。因此國內(nèi)外許多研究者都在努力探索各種形式的基因工程疫苗，使用不同的表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)主要免疫原PRRSV中的GP5、N和M蛋白基因及一些細(xì)胞因子。其中桿狀病毒一昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是目前較好的真核表達(dá)系統(tǒng)，此系統(tǒng)能夠提高外源蛋白產(chǎn)量，并且表達(dá)的蛋白能夠經(jīng)過正確的翻譯后修飾加工，更接近天然蛋白的構(gòu)象和活性，因此該系統(tǒng)被應(yīng)用于很多外源蛋白的表達(dá)。

本試驗(yàn)將PRRSV的ORF7基因和ORF5基因分別插入到polyhedrin啟動(dòng)子和p10啟動(dòng)子下，構(gòu)建重組桿狀病毒。結(jié)果表明，用重組病毒Bac-N-GP5感染Sf9細(xì)胞后，經(jīng)IFA和Western blot檢測，能夠在細(xì)胞中檢測到N和GP5蛋白的共表達(dá)。動(dòng)物免疫試驗(yàn)表明，重組桿狀病毒免疫小鼠后血清中N和GP5蛋白的抗體水平明顯高于對(duì)照組，說明重組蛋白能夠引發(fā)小鼠較強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)。本試驗(yàn)利用桿狀病毒雙表達(dá)系統(tǒng)同時(shí)在Sf9細(xì)胞中表達(dá)PRRSV N蛋白和GP5蛋白，為下一步應(yīng)用重組桿狀病毒作為PRRSV亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。

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